攜帶綠色熒光報告基因EBV-LMP2A真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞

鄢雪敏撖子建蔡琰余展鵬黃元姣，

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心

基礎(chǔ)研究

攜帶綠色熒光報告基因EBV-LMP2A真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞

鄢雪敏1撖子建2蔡琰1余展鵬1黃元姣1，2

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心

目的 構(gòu)建攜帶綠色熒光基因的真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A，并轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞。方法從EB病毒陽性的狨猴淋巴瘤細(xì)胞B95-8中克隆EB病毒編碼的EBV潛伏膜蛋白2A（latentmembrane protein 2A，LMP2A）序列，并定向克隆入pIRES2-Zs-Green1載體，雙酶切及測序鑒定重組的真核表達(dá)載體pIRES2-Zs-Green1-LMP2A；通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將重組的真核表達(dá)載體pIRES2-Zs-Green1-LMP2A轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞（實驗組），同時另設(shè)轉(zhuǎn)染pIRES2-Zs-Green1載體的陰性對照組及未轉(zhuǎn)染的空白對照組。利用質(zhì)粒所攜帶的綠色熒光蛋白表達(dá)計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR檢測目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 雙酶切及測序鑒定證實真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A構(gòu)建成功，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)實驗組和陰性對照組細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光，實驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為75%；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)實驗組細(xì)胞中有目的基因LMP2A表達(dá)，但陰性對照組和空白對照組均未檢測到目的基因表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞，目的基因LMP2A可在轉(zhuǎn)染的鼻咽癌CNE2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

鼻咽腫瘤；EBV潛伏膜蛋白2A；序列克??；pIRES2-Zs-Green1載體；p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體；基因轉(zhuǎn)染；基因表達(dá)

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）是一種線性、雙鏈DNA病毒。EB病毒感染的惡性腫瘤與潛在的感染形式有關(guān)，其編碼的潛在蛋白可間接引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。潛伏膜蛋白2A（latentmembrane protein 2A，LMP2A）是一種由EB病毒編碼的致瘤蛋白，可在感染的潛伏細(xì)胞表面形成一個貼片，亦可在細(xì)胞核周圍形成［1］。研究發(fā)現(xiàn)，LMP2A會導(dǎo)致EB病毒的持續(xù)感染［2］。而多項研究表明，原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤中LMP2A的RNA均表達(dá)，提示LMP2A可能是EB病毒感染的腫瘤發(fā)展過程中的一個趨化因子，而EB病毒編碼的LMP2A蛋白因致瘤性被廣泛研究［3～5］。本實驗將從EB病毒陽性的狨猴淋巴瘤細(xì)胞B95-8中克隆EB病毒編碼的LMP2A序列，以構(gòu)建帶綠色熒光標(biāo)記的真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A，并將其轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞，為研究EBV-LMP2A在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)及其促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞 EBV陽性的狨猴淋巴瘤細(xì)胞B95-8細(xì)胞株由本實驗室保存，從該細(xì)胞株中克隆LMP2A序列。鼻咽癌CNE2細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅中心實驗室細(xì)胞庫提供。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長狀況，2～3 d后對長勢良好且鋪滿瓶底95%左右的細(xì)胞傳代1次。

1.1.2 載體與試劑 真核表達(dá)綠色熒光蛋白載體pIRES2-Zs-Green1由本實驗室保存，T載體試劑盒購自北京全式金生物公司。TriPure購自Roche公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高保真酶（PrimeSTAR Max DNA Polymerase）、T4 DNA連接酶、預(yù)混Taq酶（Premix Taq）、快切酶Quick CutNheI、Quick CutEcoRI均購自大連寶生物（TAKARA）公司。大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司，Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LMP2A序列擴增 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中LMP2A序列設(shè)計PCR引物，上游引物為5′-AAGCTAGCCACCATGTCTGATAATGGACCCCAATCAA-3′，下游引物為5′-GAATTCTTATGCCTGAGTTGAATCAGCAGAA-3′。在上游引物中引入Nhe I酶切位點（劃線部分），同時引入岡崎片段CACC序列以易于真核細(xì)胞表達(dá)，在下游引物引入Eco R I酶切位點（劃線部分），引物由深圳華大基因合成。按照試劑盒說明書從EBV陽性的狨猴淋巴瘤細(xì)胞 B95-8提取細(xì)胞總RNA，將總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。建立高保真酶PCR體系，按照設(shè)計的引物設(shè)置PCR條件，對目的序列進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃后延伸5 min。回收PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以檢測目的產(chǎn)物分子量大小，回收純化LMP2A片段。

1.2.2 真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A的構(gòu)建及鑒定 取上述回收純化的LMP2A片段3μL，Premix Taq酶1μL，72℃條件下保溫20 min。按照pEASY-T1 Simple Kit說明書加入pEASY-T1 Simple載體1μL，37℃條件下進(jìn)行20min連接。擴大培養(yǎng)含有目的質(zhì)粒的工程菌，然后提取工程菌中LMP2A的TA克隆質(zhì)粒。用Nhe I、Eco R I酶處理pIRES2-Zs-Green1載體和LMP2A的TA克隆質(zhì)粒，回收線性p IRES2-Zs-Green1載體片段和LMP2A片段，用T4連接酶連接p IRES2-Zs-Green1載體片段和LMP2A片段以構(gòu)建真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，抽提質(zhì)粒，最后雙酶切和測序進(jìn)行鑒定，構(gòu)建真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A。

1.2.3 真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A轉(zhuǎn)染選取生長狀態(tài)良好的鼻咽癌CNE2細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為3×105接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至瓶底80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將真核表達(dá)載體pIRES2-Zs-Green1-LMP2A轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞（實驗組），同時另設(shè)轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒p IRES2-Zs-Green1的陰性對照組及未轉(zhuǎn)染的空白對照組，每組設(shè)置3組重復(fù)實驗。轉(zhuǎn)染步驟按照試劑Lipofec-tamine 3000提供的說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染12 h后更換新的含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 倒置熒光顯微鏡觀察真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染的鼻咽癌CNE2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后從培養(yǎng)箱中取出，在Olympus倒置熒光顯微鏡的普通光路和熒光光路下觀察轉(zhuǎn)染后鼻咽癌CNE2細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，每個孔隨機選取5個視野（400×）拍照，在普通光路下計算某一視野下的總細(xì)胞數(shù)，同一視野下熒光光路下計算有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染效率=熒光表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，取5個視野的轉(zhuǎn)染效率平均值，即為鼻咽癌CNE2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 RT-PCR鑒定LMP2A在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá) 按照試劑盒說明分別提取實驗組、陰性對照組和空白對照組鼻咽癌CNE2細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參，最后用LMP2A擴增引物檢測細(xì)胞中LMP2A蛋白的mRNA表達(dá)，擴增體系和條件同前，以DNA Marker為參照，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小。

2 結(jié)果

2.1 LMP2A序列擴增

從EBV陽性的狨猴淋巴瘤細(xì)胞B95-8提取總RNA，利用PCR擴增出LMP2A基因序列，1%瓊脂糖凝膠電泳確定擴增目的序列分子量。電泳結(jié)果顯示，擴增的目的基因LMP2A條帶清晰，分子量大小約為1 494 bp，與預(yù)計相符。見圖1。

圖1 LMP2A序列擴增

2.2 真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Grenn1-LMP2A的構(gòu)建與鑒定

從真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Grenn1-LMP2A轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中抽提質(zhì)粒，然后分別進(jìn)行Nhe I單酶切、Eco R I單酶切以及Nhe I、Eco R I雙酶切，在第4泳道，約為1 494 bp處可見一條帶，即為目的基因LMP2A（見圖2）。把酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，通過NCBI中的序列比對工具BLAST，將測得的序列與設(shè)計的基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果提示二者一致（見圖3），說明成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Grenn1-LMP2A。

圖2 雙酶切鑒定p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體

圖3 p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體測序結(jié)果比對

2.3 p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及綠色熒光蛋白的表達(dá)

利用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞中的綠色熒光蛋白表達(dá)情況。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)實驗組和陰性對照組細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光，其中實驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為75%，說明真核表達(dá)載體p IRES2-Zs-Green1-LMP2A可在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中正常表達(dá)。見圖4。

圖4 p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染24 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)

2.4 RT-PCR檢測LMP2A在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)目的基因LMP2A的表達(dá)，但陰性對照組和空白對照組細(xì)胞中均未檢測到目的基因表達(dá)，說明p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞。見圖5。

圖5 RT-PCR檢測LMP2A在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一［6］，由于鼻咽解剖部位的隱蔽性及臨床癥狀的多樣性，就診時大部分患者已屬中晚期，單純放療5年生存率為25%～50%［7］。鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展與飲食、環(huán)境、遺傳以及EB病毒感染等有關(guān)。常見的病原體EB病毒可轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞而引起腫瘤，在幼兒時期EB病毒無癥狀感染人體，在青春期或成年時期約三分之一的EB病毒無癥狀感染者出現(xiàn)EB病毒感染所致的自限性單核細(xì)胞增多綜合征［8］。盡管EB病毒與腫瘤發(fā)病機制的關(guān)系尚未清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)其可引起淋巴或上皮惡性腫瘤，NK-T淋巴細(xì)胞瘤、Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、鼻咽癌等惡性腫瘤均與EB病毒感染密切相關(guān)［9，10］。研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌患者血漿中常檢測到EB病毒衣殼抗原-抗體（EBV-VCA-lgA）且較正常人升高，認(rèn)為檢測EBV-VCA-lgA在血清中的表達(dá)水平，有助于初步篩選、輔助診斷鼻咽癌［11］。

LMP2A蛋白是由一個長N-末端、12個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短C-端組成，可在感染的潛伏細(xì)胞表面形成一個貼片，亦可在細(xì)胞核周圍形成［1］。LMP2A的N-末端包含與其他蛋白分子交流所必需的8個磷酸化酪氨酸殘基和7個脯氨酸域［4］，在B細(xì)胞和上皮細(xì)胞中能夠通過AKT通路激活磷酸肌醇-3激酶［12～14］，在人類胃癌細(xì)胞系HSC-39中可激活非依賴型錨細(xì)胞生長［15］。同時LMP2A是一種EB病毒編碼的致瘤蛋白，可通過激活宿主細(xì)胞相關(guān)信號通路促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長［14～16］。近年來EB病毒編碼的LMP2A蛋白因其致瘤性被廣泛研究。本課題組前期從EBV陽性的B95-8細(xì)胞中成功擴增出LMP1序列，并在鼻咽癌CNE1、CNE2細(xì)胞中表達(dá)［17］，為本研究提供了重要的參考。本實驗選取EB病毒陽性的狨猴淋巴瘤細(xì)胞B95-8克隆EB病毒編碼的LMP2A序列，在克隆LMP2A序列實驗中，基于前期成熟的克隆條件和實驗技術(shù)，電泳結(jié)果顯示，擴增的目的基因LMP2A條帶清晰，分子量大小約為1 494 bp，與預(yù)計相符。而進(jìn)一步將構(gòu)建好的p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切以及測序檢測克隆的LMP2A片段，結(jié)果證實測序結(jié)果與克隆出的序列一致，說明克隆實驗結(jié)果可信，成功構(gòu)建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體，為后續(xù)細(xì)胞實驗提供了實驗基礎(chǔ)。

p IRES2-Zs-Green1載體是一種在表達(dá)目的蛋白的同時可表達(dá)綠色熒光蛋白的載體，本研究在綠色熒光蛋白標(biāo)記的p IRES2-Zs-Green1載體中定向插入目的序列LMP2A，將構(gòu)建的p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞。在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體組和轉(zhuǎn)染pIRES2-Zs-Green1載體的細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光，通過p IRES2-Zs-Green1載體的綠色熒光蛋白表達(dá)觀察實驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率較高，約為75%，說明pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體可在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中正常表達(dá)。同時，采用RT-PCR檢測LMP2A基因在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞發(fā)現(xiàn)目的基因LMP2A的表達(dá)，但陰性對照組和空白對照組細(xì)胞中均未檢測到目的基因表達(dá)，說明p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表達(dá)載體，并將其成功轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞，為后續(xù)研究LMP2A蛋白在鼻咽癌細(xì)胞行為學(xué)及分子機制中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

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［2016-06-23收稿］［2016-07-25修回］［編輯 羅惠予］

Construction of an EBV-LMP2A eukaryotic expression plasm id with a green fluorescent protein reporter and transfection into nasopharyngeal carcinoma cells

Yan Xuemin1，Han Zijian2，Cai Yan1，Yu Zhanpeng1，Huang Yuanjiao1，2（1Biochemistry and Molecular Biology Department of Guangxi Medical University；2Experiment Center of Medical Science，GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Huang Yuanjiao.E-mail：hyjgxmu@126.com

objective To construct the eukaryotic expression plasmid p IRES2-Zs-Green1-LMP2A encoding green fluorescent protein，and to transfect it into CNE2 nasopharyngeal carcinoma cells.M ethods The LMP2A sequence from EBV-positive B95-8 cells was cloned into the vector p IRES2-Zs-Green1.The identity of the resulting pIRES2-Zs-Green1-LMP2A was confirmed using restriction enzymes and sequencing.The expression plasmid was transfected into CNE2 cells using a liposome-based method.The resulting transfectants were compared with negative controls transfected with p IRES2-Zs-Green1 and with untransfected cells in terms of expression of green fluorescent protein and LMP2A transcription.Results Restriction enzyme digestion and sequencing showed that pIRES2-Zs-Green1-LMP2A was constructed successfully.Transfection of pIRES2-Zs-Green1-LMP2A or empty vector p IRES2-Zs-Green1 led to expression of green fluorescent protein，and fluorescence microscopy indicated transfection efficiency of approximately75%.Only cells transfected with the complete plasmid p IRES2-Zs-Green1-LMP2A produced LMP2A mRNA.Conclusion The eukaryotic expression plasmid p IRES2-Zs-Green1-LMP2A has been successfully constructed，and it can drive steady expression of LMP2A in CNE2 cells，making this system useful for studies of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal neoplasm；EBV latentmembrane protein 2A；Sequence clone；Vector p IRES2-Zs-Green1；Eukaryotic expression vector p IRES2-Zs-Green1-LMP2A；Gene transfection；Gene expression

R739.6

A

1674-5671（2016）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.04.02

國家自然科學(xué)基金資助項目（81260405）；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點實驗室基金項目（GK2013-A-02-02）

黃元姣。E-mail：hyjgxmu@126.com