β-catenin過表達(dá)鼻咽癌CNE2細(xì)胞模型的構(gòu)建

林可焴 蘇穎 何火聰 鄒長(zhǎng)棪 陳超

作者單位：350014 福州 福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院 福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室

基礎(chǔ)研究

β-catenin過表達(dá)鼻咽癌CNE2細(xì)胞模型的構(gòu)建

林可焴 蘇穎 何火聰 鄒長(zhǎng)棪 陳超

作者單位：350014 福州 福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院 福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室

目的 構(gòu)建β-catenin真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin并轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞，檢測(cè)β-catenin在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)。方法 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增目的基因β-catenin，膠回收純化后克隆至pGEM-T Easy載體，挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行kpn I/xba I雙酶切和PCR鑒定，用T4 DNA連接酶將目的基因β-catenin與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Hygro（+）連接，構(gòu)建重組的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，再次抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR、kpn I/xba I雙酶切和測(cè)序鑒定，然后用FuGENE HD將純化的pcDNA3.1（+）/β-catenin轉(zhuǎn)染入鼻咽癌CNE2細(xì)胞，經(jīng)Hygromycin B篩選，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2/β-catenin中β-catenin的表達(dá)。結(jié)果 PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定表明，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Western blot檢測(cè)表明，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2比較，被轉(zhuǎn)染的CNE2/β-catenin細(xì)胞能夠上調(diào)目的基因β-catenin的表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論 成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin，并能在轉(zhuǎn)染的CNE2/β-catenin細(xì)胞上調(diào)目的基因β-catenin的表達(dá)。

鼻咽腫瘤；真核表達(dá)載體；β-catenin；細(xì)胞模型

β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心，研究表明鼻咽癌細(xì)胞中β-catenin表達(dá)異常，而β-catenin異常高表達(dá)與鼻咽癌不良預(yù)后密切相關(guān)［1，2］。本研究通過構(gòu)建β-catenin真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/βcatenin并轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞，觀察其在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而構(gòu)建β-catenin過表達(dá)鼻咽癌CNE2細(xì)胞模型，以期為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路在鼻咽癌的生物活性和作用提供研究模型。

1 材料和方法

1.1 材料

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2由福建省腫瘤醫(yī)院放射生物研究室培養(yǎng)保存。大腸桿菌DH5α購(gòu)自Invitrogen公司，pGEM-T Easy載體購(gòu)自Promaga公司，真核表達(dá)載體pcDNA 3.1/Hygro（+）購(gòu)自Invitrogen公司；RPMI-1640購(gòu)自Hyclone公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料有限公司；EX taq酶和TRizol購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，限制性內(nèi)切酶kpn I和xba I購(gòu)自NEB公司，F(xiàn)uGENEHD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GeneBank中β-catenin基因mRNA的編碼區(qū)序列（X87838.1）及xbaⅠ和kpnⅠ切酶保護(hù)堿基的要求設(shè)計(jì)與合成β-catenin擴(kuò)增的PCR引物。β-catenin上游引物：5′-GGGGTACCATGGCTACTCAAGCTGATT-3’，β-catenin下游引物：5′-GCTCTAGATTACAGGTCAGTATCAAACCAGGC-3′，PCR產(chǎn)物為2 346 bp。其中在上游引物5′端引入kpnⅠ的酶切位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基GG，下游引物5′引入xbaⅠ的酶切位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基GC。

1.2.2 目的基因β-catenin的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 收集鼻咽癌CNE2細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)體系：RNA 3μg，Oligo（dT，0.5μg/μL）1μL，5倍反應(yīng)緩沖液4μL，抑制劑1μL，dNTPmix（10mmol/L）2μL，反轉(zhuǎn)錄酶200 U，焦碳酸二乙處理的純水（DEPC-treatedwater，DEPC水）補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件：42℃反應(yīng)60min，70℃水浴5min終止反應(yīng)后立即冰浴。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2μL、10×buffer 2μL、dNTP 1.6μL、上下游引物各1μl、Taq酶0.2μL、加DEPC水至20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃45 s，55℃45 s，72℃3min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，膠回收純化目的基因β-catenin產(chǎn)物。

1.2.3 目的基因β-catenin的亞克隆 用T4 DNA連接酶將膠回收純化的β-catenin與pGEM-T Easy載體于4℃連接過夜，得到亞克隆質(zhì)粒pGEM-T/β-catenin，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，取菌液100μL涂于含IPTG/ X-gal/氨芐青霉素的LB平板上，倒扣37℃培養(yǎng)過夜后挑選白色陽(yáng)性克隆，于LB培養(yǎng)基擴(kuò)培后抽提質(zhì)粒，kpn I和xba I雙酶切，然后膠回收雙酶切后的目的基因產(chǎn)物β-catenin。以從白色陽(yáng)性克隆抽提的質(zhì)粒pGEM-T/β-catenin為模板，用上述β-catenin的PCR擴(kuò)增引物對(duì)質(zhì)粒pGEM-T/β-catenin進(jìn)行PCR鑒定。1.2.4 真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin的構(gòu)建

將上述kpn I和xba I雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的基因片段β-catenin，用T4 DNA連接酶將β-catenin與經(jīng)同樣雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Hygro（+）于4℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂于含50μg/μL氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行kpn I和xba I雙酶切鑒定、PCR鑒定和DNA測(cè)序鑒定。

1.2.5 真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞 CNE2細(xì)胞接種于24孔板，密度達(dá)80%～90%時(shí)用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將純化后的pcDNA3.1（+）/β-catenin真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化分離細(xì)胞，用含Hygromycin B的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后接種到6孔板中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)染后的CNE2/β-catenin細(xì)胞；然后挑選兩個(gè)細(xì)胞克?。麨镃NE2/β-catenin/A和CNE2/β-catenin/B），進(jìn)行β-catenin表達(dá)鑒定。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2、CNE2/β-catenin/A和CNE2/β-catenin/B細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。內(nèi)參照β-actin上游引物：5′-GGAAATCGTGCGTGACATT-3′，下游引物：5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′。β-catenin上游引物：5′-GCAGCAACAGTCTTACC-3′，下游引物：5′-AC A GGACTTGGGAGGTAT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（20μL）：去離子水3μL，PCR上下游引物（10μmol/L）各1μL，MasterMix10μL，DNA模板5μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃10min；擴(kuò)增95℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃10 s，60℃1min，然后升溫至95℃（每度采集5次熒光，連續(xù)采集）；冷卻40℃30 s。以2-ΔΔCt值代表β-catenin基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE2、CNE2/β-catenin/A和CNE2/β-catenin/ B細(xì)胞，胰酶消化后PBS清洗，1 200 r/min離心5min，去上清液后收集細(xì)胞并裂解，4℃高速離心后取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將定量蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)至NC膜，3%牛血清白蛋白（BSA）封閉，TTBS（Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 150 mmol/L，0.1%吐溫-20，pH 7.2）洗膜后加入β-catenin一抗與膜上抗原結(jié)合，用相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗與其反應(yīng)后加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，多功能成像分析系統(tǒng)成像。以β-catenin蛋白與β-actin蛋白電泳條帶的吸光度比值表示β-catenin蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因β-catenin的擴(kuò)增

由鼻咽癌CNE2細(xì)胞提取的總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，通過凝膠電泳驗(yàn)證，所獲得的PCR目的產(chǎn)物片段約為2 346 bp（見圖1），該片段與GeneBank中的β-catenin基因（X87838.1）CDS序列大小一致，表明β-catenin基因被成功獲取。

圖1 目的基因β-catenin的PCR擴(kuò)增

2.2 目的基因β-catenin的亞克隆及篩選鑒定

目的基因β-catenin與pGEM-T Easy連接而成的亞克隆質(zhì)粒pGEM-T/β-catenin經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約為5 361 bp處可見一條明亮譜帶，與β-catenin和pGEM-T Easy兩者連接而成的亞克隆質(zhì)粒大小一致（見圖2泳道1）；亞克隆質(zhì)粒pGEM-T/β-catenin經(jīng)kpn I與xba I雙酶切后，在約為3 015 bp和2 346 bp處各見一條明亮的譜帶（見圖2泳道2），分別與pGEM-T Easy和β-catenin大小一致；以亞克隆質(zhì)粒pGEM-T/β-catenin為模板進(jìn)行β-catenin的PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在2 346 bp處有一條與β-catenin大小一致的譜帶（見圖2泳道3）。以上結(jié)果說明成功構(gòu)建了pGEM-T/β-catenin亞克隆載體。

圖2 pGEM-T/β-catenin亞克隆載體的構(gòu)建

2.3 pcDNA3.1（+）/β-catenin真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后抽提質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約為7 946 bp處有一明亮譜帶，大小與pcDNA3.1（+）/β-catenin分子量一致（見圖3泳道1）。重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/β-catenin經(jīng)kpn I與xba I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，在約為5 600 bp和2 346 bp處各見一條明亮譜帶，分別與pcDNA3.1/Hygro（+）和β-catenin大小一致（見圖3泳道2）。以pcDNA3.1（+）/ β-catenin質(zhì)粒為模板，用目的基因β-catenin上下游引物經(jīng)PCR擴(kuò)增，鑒定目的基因，結(jié)果在2 346 bp處可見一條明顯的擴(kuò)增譜帶（見圖3泳道3），與酶切得到的目的基因β-catenin對(duì)應(yīng)的譜帶位置一致。把經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定正確的pcDNA3.1（+）/β-catenin質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，通過NCBI中的序列比對(duì)工具BLAST將測(cè)得的序列與設(shè)計(jì)的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果提示二者一致，說明成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin。

圖3 真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin的構(gòu)建

2.4 CNE2/β-catenin轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-catenin mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2/β-catenin/A及 CNE2/β-catenin/B中 β-catenin的mRNA表達(dá)分別為2.243±0.011和3.894±0.070，較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2的1明顯上調(diào)，兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說明pcDNA3.1（+）/β-catenin轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞可明顯上調(diào)β-catenin基因的表達(dá)。見圖4。

2.5 CNE2/β-catenin轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2/ β-catenin/A和CNE2/β-catenin/B的β-catenin表達(dá)分別為0.458±0.015和0.842±0.040，較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2的0.257±0.010明顯上調(diào)，與未轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說明pcDNA3.1（+）/ β-catenin轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞可明顯上調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)。見圖5。

圖4 CNE2/β-catenin轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-catenin m RNA的表達(dá)

圖5 CNE2/β-catenin轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討論

鼻咽癌為我國(guó)南方地區(qū)常見的惡性腫瘤，其病因尚不明確，目前認(rèn)為鼻咽癌是由多因素引起，遺傳易感性、環(huán)境因素以及EB病毒感染在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。放射治療是鼻咽癌的主要治療方法。隨著放療技術(shù)的進(jìn)步及綜合治療的應(yīng)用，鼻咽部療效顯著提高，早期患者5年生存率可達(dá)80%～90%，中晚期患者可達(dá)60%～70%，但10%～20%的早期及20%～30%的中晚期患者仍出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3，4］。因此，研究鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及其信號(hào)通路，進(jìn)而探索有效的作用靶點(diǎn)，將可能為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和治療的研究提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該信號(hào)途徑的調(diào)控異常在多種人類腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、食管癌等發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［5～8］。多項(xiàng)研究表明，在腫瘤細(xì)胞中存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常活化。目前認(rèn)為，β-catenin降解障礙致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的 β-catenin積聚并進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因CyclinD1、c-myc的轉(zhuǎn)錄，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路致癌的關(guān)鍵［9～11］。

近年多項(xiàng)研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控異常與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系［12，13］。研究提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控異?？捎绊懕茄拾┲委熜Ч?4］。突變的β-catenin與鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中細(xì)胞質(zhì)的β-catenin主要作用為減少鼻咽癌細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。β-catenin的異常高表達(dá)與鼻咽癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，其在早期鼻咽癌有更高的過表達(dá)率［1，2］。低分化鼻咽癌細(xì)胞比高分化鼻咽癌細(xì)胞有更高水平的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)，以及更高的β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，說明前者的Wnt/β-catenin信號(hào)通路較后者明顯處于更高的活化狀態(tài)，提示W(wǎng)nt/ β-catenin信號(hào)通路可能在抑制鼻咽癌細(xì)胞分化中起重要作用［16，17］。綜上認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?？赡芘c鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。因此，構(gòu)建相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究模型，將有助于進(jìn)一步探討Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

本研究從低分化鼻咽癌細(xì)胞（CNE2）中提取總RNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增β-catenin基因，經(jīng)TA亞克隆、藍(lán)白篩選、kpn I和xba I雙酶切后，將目的片段與帶有潮霉素抗性基因的pcDNA3.1/Hygro（+）真核表達(dá)載體連接，從而提高了重組克隆的準(zhǔn)確性和可靠性。由于真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Hygro（+）含有CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、Hygromycin抗性基因等，目的基因β-catenin可在導(dǎo)入鼻咽癌CNE2細(xì)胞中獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的高水平表達(dá)，避免后續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)粒丟失。通過對(duì)重組載體pcDNA3.1（+）/β-catenin的kpn I和xba I雙酶切、PCR以及測(cè)序鑒定，證明重組質(zhì)粒含有與GeneBank中β-catenin相同的編碼區(qū)序列（X87838.1），說明真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/ β-catenin構(gòu)建成功。進(jìn)而，通過FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將純化的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/β-catenin轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞，經(jīng)Hygromycin B篩選后獲得β-catenin轉(zhuǎn)染的兩株鼻咽癌細(xì)胞（CNE2/β-catenin/A和CNE2/β-catenin/B）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)表明，兩株轉(zhuǎn)染細(xì)胞均能夠過表達(dá)目的基因β-catenin，提示成功構(gòu)建了β-catenin過表達(dá)的鼻咽癌CNE2細(xì)胞模型（CNE2/β-catenin/A和CNE2/ β-catenin/B）。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1（+）/β-catenin真核表達(dá)載體，建立了β-catenin過表達(dá)的鼻咽癌CNE2細(xì)胞模型（CNE2/β-catenin/A和CNE2/β-catenin/B），為后續(xù)進(jìn)一步探討β-catenin在鼻咽癌中的作用機(jī)制提供研究模型。

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［2016-06-24收稿］［2016-07-29修回］［編輯 羅惠予］

Construction of a CNE2 cellular model of nasopharyngeal carcinoma involvingβ-catenin overexpression

Lin Keyu，Su Ying，He Huocong，Zou Changyan，Chen Chao（Laboratory of Radiation Oncology and Radiobiology，F(xiàn)ujian Provincial Cancer Hospital，Teaching Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)ujian Key Laboratory of Tumor Translational Cancer Medicine，F(xiàn)uzhou 350014，P.R.China）

Su Ying.E-mail：zjsuying@hotmail.com

objective The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+）/β-catenin was constructed and transfected into CNE2 nasopharyngeal carcinoma cells，andβ-catenin overexpression was verified in transfected cells.Methods Theβ-catenin gene was amplified by RT-PCR，gel-purified and cloned into pGEM-T Easy，then transformed into E.coli.Positive cloneswere screened by digesting extracted plasmid with Kpn I/Xba I and by analyzing with PCR.The subclonedβ-catenin gene was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1/Hygro（+）using T4 DNA ligase，resulting in the recombinanteukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+）/ β-catenin.This construct was transformed into competent DH5αcells and positive clones were identified using PCR，Kpn I/Xba I digestion and DNA sequencing.Purified pcDNA3.1（+）/β-catenin was transfected into CNE2 cells using FuGENE HD transfection reagent，and transfectantswere selected using hygromycin B.Expression ofβ-catenin in transfected cellswas assessed using real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.Results The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+）/β-catenin wasconstructed and confirmed by PCR，double enzyme digestion and DNA sequencing.Overexpression ofβ-catenin in transfected CNE2 cells was confirmed using real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting（P<0.01）.Conclusion The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+）/β-catenin was constructed and can be transfected into CNE2 cells to up-regulateβ-catenin.These transfected cellsmay provide an in vitromodel for studying the role ofβ-catenin in nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal neoplasm；Eukaryotic expression vector；β-catenin；Cellmodel

R739.6

A

1674-5671（2016）04-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.04.01

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014J01299）；福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2014Y0014）；國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目［國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函（2013）554號(hào)］

蘇穎。E-mail：zjsuying@hotmail.com