廣東地區(qū)感染養(yǎng)殖羅非魚的無乳鏈球菌分子分型研究*

方 偉，梁宇恒，寧 丹，柯碧霞，柯昌文，鄧小玲，彭華林，孫九峰，王云新

(1. 廣東省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510222;2. 廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 511430;3. 廣東省公共衛(wèi)生研究院，廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 511430)

廣東地區(qū)感染養(yǎng)殖羅非魚的無乳鏈球菌分子分型研究*

方 偉1，梁宇恒2，寧 丹3，柯碧霞2，柯昌文2，鄧小玲2，彭華林1，孫九峰3，王云新1

(1. 廣東省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510222;2. 廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 511430;3. 廣東省公共衛(wèi)生研究院，廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 511430)

以廣東省內(nèi)5個(gè)羅非魚Oreochromisniloticus主要養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)分離的無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae為研究目標(biāo)，通過毒力基因PCR檢測、多位點(diǎn)序列分型、脈沖場凝膠電泳技術(shù)研究廣東地區(qū)感染羅非魚的無乳鏈球菌分子特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)170株分離無乳鏈球菌中毒力基因的攜帶率介于60.59%～100%之間，毒力基因攜帶形成10個(gè)譜系，dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac(38.24%， 65/170)，dltr-bca-sodA-spb1-bac(23.53%，40/170)和dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB(22,35%，38/170)為主要的譜系，dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb(8.24%，14/170)和dltr-bca-sodA-spb1(4.71%， 8/170)次之。多位點(diǎn)序列分型研究證實(shí)170株菌在7個(gè)位點(diǎn)均為單一的等位基因，為adhP(10), pheS(1), atr(2), glnA(1), sdhA(3), glcK(2), tkt(2)，序列型為ST7型。146株菌脈沖場凝膠電泳結(jié)果表明146株菌分為6個(gè)簇(A-D，F(xiàn)，G)，相似性介于86%～100%之間。A(18)，B(16)，C(103)，D(7)為主要的遺傳簇，占菌株數(shù)的98.63%(144/146)。基因簇A，C在4個(gè)采樣區(qū)均有發(fā)現(xiàn)；基因簇B分布在吳川、茂名和陽江；基因簇D分布在茂名、珠海和陽江；基因簇F和G分別來自茂名和珠海。在A-D遺傳簇中均有發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的菌株呈現(xiàn)100%的相似性，為同一克隆株。結(jié)果表明廣東省主要羅非魚養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)感染鏈球菌攜帶毒力基因比率高，序列型均為高致病的ST7型別，不同地區(qū)間具有相同的PFGE型別，不同地區(qū)間交叉?zhèn)鞑ジ腥镜目赡芨摺?/p>

羅非魚Oreochromisniloticus; 無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae; 毒力基因; MLST; PFGE

無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae屬于B群鏈球菌(Group BStreptococcus，GBS)，是一種廣泛分布于自然界的革蘭氏陽性菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原性的不同，可分為10種血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ型)，可引起人類的敗血癥、肺炎及腦膜炎等疾病[1-2]，也是引起羅非魚Oreochromisniloticus鏈球菌病主要病原菌[3-6]。

2008年之前，廣州地區(qū)引起羅非魚感染的鏈球菌多為海豚鏈球菌。2009年廣東暴發(fā)無乳鏈球菌感染，其后，無乳鏈球菌成為主要病原菌。2008 年張新艷等[7]首次報(bào)道無乳鏈球菌為廣州某養(yǎng)殖場羅非魚暴發(fā)病的病原菌，并對(duì)該病原菌分離鑒定及致病性進(jìn)行了研究；盧邁新等[8]在海南省發(fā)病的羅非魚中分離到無乳鏈球菌；隨后柯劍、張俊等[9-10]分別對(duì)廣州地區(qū)羅非魚感染鏈球菌進(jìn)行了病原學(xué)檢測及初步的分析，均表明無乳鏈球菌是羅非魚鏈球菌病的重要病原菌。2012年郭玉娟[11]對(duì)我國南方地區(qū)羅非魚無乳鏈球菌進(jìn)行了分子流行病學(xué)研究，結(jié)果表明：羅非魚感染鏈球菌在不同地區(qū)具有相同的血清型、MLVA分型及表面C蛋白，與對(duì)照組牛源的無乳鏈球菌有明顯的差異，因而推測我國南方地區(qū)魚源無乳鏈球菌未發(fā)生明顯的變異。已有的研究已經(jīng)部分闡明了廣東部分地區(qū)流行的菌株種類、血清型、耐藥特征，但大多的研究結(jié)果僅基于少量菌株，因而對(duì)系統(tǒng)闡明廣東地區(qū)無乳鏈球菌流行特征仍缺乏說服力[7-11]。本中心研究人員依托廣東省魚病監(jiān)測系統(tǒng)，采集廣東省多個(gè)羅非魚養(yǎng)殖場的發(fā)病魚樣本，通過病原菌的分離、理化與分子鑒定已分離到多株無乳鏈球菌菌株，本研究應(yīng)用毒力基因攜帶情況檢測、多位點(diǎn)序列分型、脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)開展感染羅非魚的無乳鏈球菌分子流行病學(xué)研究，為闡明該菌的群體組成，在廣東地區(qū)的流行規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、試驗(yàn)材料及設(shè)備儀器

2014年8-12月，從廣東茂名、肇慶、吳川、珠海和陽江市多個(gè)羅非魚養(yǎng)殖場采集健康羅非魚樣本206份，魚體質(zhì)量1～2 kg。細(xì)菌分離培養(yǎng)獲得無乳鏈球菌170株，所有菌株均經(jīng)過生理生化、特異性PCR擴(kuò)增、血清型鑒定(Ia)[12]。

血瓊脂平板及其他常用試劑等購自廣州市迪景微生物科技有限公司；PCR反應(yīng)GoTaq試劑購自美國Promega公司、DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司、DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)試劑購自大連寶生物科技有限公司、瓊脂糖凝膠購自美國Cambrex公司。

研究中所用到的主要儀器包括脈沖場凝膠電泳購自美國Bio-Rad公司，培養(yǎng)箱購自美國shellab公司、金屬浴購自美國eppendorf公司、PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 毒力基因檢測

[13]，應(yīng)用PCR法檢測無乳鏈球菌毒力基因：表面定位蛋白GBS(spb1)、C5a肽(scpB)、C蛋白apha亞基(bca)、C蛋白beta亞基(bac)、調(diào)節(jié)蛋白(dltR)、CAMP因子(cfb)、超氧化物歧化酶(sodA)。挑取經(jīng)劃線培養(yǎng)的單菌落菌株，參考試劑盒說明提取菌體基因組DNA。PCR 模板為細(xì)菌基因組DNA，PCR終反應(yīng)體系: 總反應(yīng)體系為25 μL，包括2 × PCR Mix 12.5 μL，10 pmol/L引物各1 μL(表1)，其余以無菌水補(bǔ)齊。PCR 反應(yīng)條件見表1。PCR 產(chǎn)物w=1%瓊脂糖凝膠電泳后觀測并拍照。

1.3 多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)

鏈球菌多位點(diǎn)序列分型參照MLST鏈球菌公用數(shù)據(jù)庫資料(http:∥pubmlst.org)[14]，通過PCR擴(kuò)增乙醛脫氫酶(adhP)、苯丙氨酰-tRNA合成酶(pheS)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(atr)、谷氨酸合成酶(glnA)、絲氨酸脫氫酶(sdhA)、葡萄糖激酶(glcK)、轉(zhuǎn)酮醇酶(tkt)7個(gè)基因，并進(jìn)行測序、網(wǎng)上比對(duì)分析。PCR擴(kuò)增及測序引物見表2，PCR擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體系為25 μL，包括2 × PCR Mix 12.5 μL，10 pmol/L引物各1 μL(表1)，其余以無菌水補(bǔ)齊。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)( 94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min) ，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保持。PCR 產(chǎn)物w=1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果陽性送深圳華大基因公司測序。測序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件包中Seqman軟件處理后，進(jìn)行在線逐一比對(duì)所屬的序列型。

表1 無乳鏈球菌毒力基因檢測引物及PCR擴(kuò)增條件

1.4 脈沖場凝膠電泳分型

參照已有文獻(xiàn)資料脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)操作方法[15]。純化的單菌落接種血培養(yǎng)平板，過夜培養(yǎng)后收集菌體，以緩沖液洗滌菌體兩次(Tris-HCl 0.01 mol/L, EDTA 0.1 mol/L , pH 8.0)；菌體在含有1.0 mg/mL的溶菌酶和1.0 mg/mL的蛋白酶K溶液中消化，然后與等體積的w=1%低熔點(diǎn)瓊脂混合制備膠塊；膠塊在含有12U的SmaⅠ內(nèi)切酶中消化(50 mmol/L Tris, 50 mmol/L EDTA,w=1% SDS, 0.1 mg/mL protein K)，消化后的膠塊上機(jī)電泳。電泳條件：電泳方向轉(zhuǎn)換時(shí)間4 s，40 s，電泳時(shí)間20 h，泳動(dòng)角度120°，電壓6 V/cm(CHEF Mapper XA，Bio-Rad, USA)。PFGE結(jié)果在BioNumerics 6.5(Applied Maths BVBA, Belgium)軟件分析，具體建樹分析參數(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行，以非加權(quán)的幾何平均數(shù)(unweighted pair group method using arithmetic averages, UPGMA)方法建樹，采用基于條帶比較的Dice系數(shù)衡量PFGE帶型之間的相似度。

2 結(jié) 果

2.1 毒力基因檢測

170株分離無乳鏈球菌中表面定位蛋白GBS(spb1)攜帶率98.24%(167/170)、C5a肽(scpB)攜帶率68.24%(167/170)、C蛋白apha亞基(bca)攜帶率100%(170/170)、C蛋白beta亞基(bac)攜帶率94.71%(161/170)、調(diào)節(jié)蛋白(dltR)攜帶率100%(170/170)、CAMP因子(cfb)攜帶率60.59%(103/170)、超氧化物歧化酶(sodA)攜帶率98.82%(168/170)。170株菌攜帶毒力基因形成10個(gè)譜系，其中dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac(38.24%， 65/170)，dltr-bca-sodA-spb1-bac(23.53%，40/170)和dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB(22,35%，38/170)為主要的譜系，dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb(8.24%，14/170)和dltr-bca-sodA-spb1(4.71%， 8/170)次之。

表2 無乳鏈球菌多位點(diǎn)序列型擴(kuò)增引物及擴(kuò)增片段大小

F：正向引物；R：反向引物；SF:正向測序引物；SR:反向測序引物

2.2 MLST分型

獲得的序列結(jié)果經(jīng)過Seqman軟件分析，參照MLST標(biāo)準(zhǔn)長度截取DNA序列，進(jìn)行等位基因比對(duì)(http:∥pubmlst.org)。等位基因比對(duì)完成后，再將各位點(diǎn)數(shù)值依次輸入網(wǎng)站對(duì)應(yīng)基因座位號(hào)碼，進(jìn)行MLST序列的判定。目前對(duì)170株無乳鏈球菌MLST分型基本完成，結(jié)果表明adhP, pheS, atr, glnA, sdhA, glcK, tkt 7個(gè)位點(diǎn)均可以成功擴(kuò)增出目的基因條帶。經(jīng)過目的基因測序、分析、網(wǎng)上比對(duì)表明所有170株菌在7個(gè)位點(diǎn)均為單一的等位基因，為adhP(10), pheS(1), atr(2), glnA(1), sdhA(3), glcK(2), tkt(2)，序列型為ST7型。

2.3 脈沖場凝膠電泳分型

對(duì)無乳鏈球菌共計(jì)146株進(jìn)行PFGE分析，結(jié)果表明無乳鏈球菌基因組經(jīng)SmaI酶切后產(chǎn)生7～11個(gè)片段(圖1)。經(jīng)聚類分析后，146株菌分為6個(gè)簇(A-D，F(xiàn)，G)，相似性介于86%～100%之間。A(18)，B(16)，C(103)，D(7)為主要的遺傳簇，占菌株數(shù)的98.63%(144/146)?；虼谹，C在4個(gè)采樣區(qū)均有發(fā)現(xiàn)；基因簇B分布在吳川、茂名和陽江；基因簇D分布在茂名、珠海和陽江；基因簇F和G分別來自茂名和珠海。在A-D遺傳簇中均有發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的菌株呈現(xiàn)100%的相似性，為同一進(jìn)化的克隆菌株(圖1)。

圖1 無乳鏈球菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)部分結(jié)果(SmaI)。146株菌聚類分為6個(gè)遺傳簇(A-D，F(xiàn)，G)，A-D為廣東地區(qū)的主要遺傳簇Fig.1 The results of PFGE with SmaI. One hundred and forty-six isolates were assigned to six clusters (A-D, F,G). Clusters A to D were the predominant clusters in Guangdong

3 討 論

在前期對(duì)廣東省5個(gè)羅非魚主要養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)的羅非魚病原進(jìn)行采樣、分離鑒定的基礎(chǔ)上，本研究首先通過PCR的方法檢測分離菌株攜帶毒力基因的情況，發(fā)現(xiàn)170株無乳鏈球菌中，毒力基因的攜帶率介于60.59%～100%之間，形成的10個(gè)譜系中前3個(gè)譜系占84.12%。cfb基因的攜帶率為60.59%，它是B群鏈球菌特有基因，編碼CAMP因子或溶血促進(jìn)因子，能與金黃色葡萄球菌分泌的B溶血毒素共同作用，促進(jìn)綿羊紅細(xì)胞的溶血及胞膜成分的溶解，也是一種強(qiáng)毒力因子，在細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞與抗吞噬作用等方面起重要作用。其它毒力基因多參與菌體抵御宿主細(xì)胞免疫因子攻擊、參與細(xì)胞粘附等功能，高毒力基因攜帶率也提示這些菌株可能具有較強(qiáng)的致病力[16]。

文獻(xiàn)資料顯示無乳鏈球菌分子分型研究目前常用方法有多位點(diǎn)序列分型(MLST)[14]、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析( MLVA)[17]，以及脈沖場凝膠電泳(PFGE)[15]。研究中，我們應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型及脈沖場凝膠電泳對(duì)前期分離的170無乳鏈球菌進(jìn)行分子分型研究，以探討廣東地區(qū)羅非魚成魚中攜帶的無乳鏈球菌的主要型別及分布特征。多位點(diǎn)序列型的結(jié)果顯示所有菌株在7個(gè)位點(diǎn)均為adhP(10)，pheS(1)，atr(2)，glnA(1)，sdhA(3)，glcK(2)，tkt(2)，所屬的序列型為ST7型，已有的資料表明，ST7型為高致病ST型，可引起人、牲畜、魚類的感染，因而本次分離的菌株可能均為高致病菌株，與毒力基因高攜帶率相一致。

PFGE的結(jié)果顯示146株菌分屬于6個(gè)遺傳簇，其中C型為主要的基因簇，其次為A，B，D型。FPGE分型不具有地域特異性，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在不同地域中，可流行相同的克隆菌株(同源性100%)，這一結(jié)果與前期其它學(xué)者的研究結(jié)果相一致[15]，提示廣東地區(qū)羅非魚中流行的無乳鏈球菌高度一致，可能經(jīng)歷過一次群體的純化過程。研究中，我們應(yīng)用PFGE作為分子分型研究方法，而并沒有使用MLVA，是因?yàn)镻FGE的結(jié)果可重復(fù)性高，在不同的實(shí)驗(yàn)室間可以做橫向?qū)Ρ确治?。本次研究結(jié)果與其它研究者的研究結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)相同的分型中，電泳帶型一致性接近100%。但有研究者報(bào)道，MLVA比脈沖場電泳( PFGE) 和多位點(diǎn)序列分型( MLST) 區(qū)分度更高，并且方便、經(jīng)濟(jì)[18]。但我們認(rèn)為，MLVA的研究方案并不成熟，不同的操作者間難以標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)提取的DNA質(zhì)量、操作者技術(shù)水平，對(duì)MLVA結(jié)果判讀的準(zhǔn)確性等因素都將影響MLVA的結(jié)果，而PFGE、MLST已經(jīng)建立了標(biāo)準(zhǔn)的操作流程，結(jié)果可比性高，更具有現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值。

Radtke等[17]通過MLVA 對(duì)無乳鏈球菌進(jìn)行分型，研究表明11個(gè)位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)的變異度最大，進(jìn)而選取這5個(gè)位點(diǎn)建立MLVA的方法。隨后郭玉娟等[11]選用這5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳和部分目的片段測序結(jié)果表明所有魚源無乳鏈球菌均為同一型，而來源于人及牛的菌株帶型則有較大差異。與此相似，Pereira 等[19]用PFGE 分析也發(fā)現(xiàn)魚源、人源和牛源無乳鏈球菌在基因型上均不相關(guān)。雖然牛源和魚源的無乳鏈球菌分子血清型均為Ⅰa 型，但是它們的表面蛋白抗原基因不同，這表明魚源和牛源無乳鏈球菌在表面蛋白抗原上存在明顯的差異性。雖然本研究中，我們沒有納入人源和牛源的無乳鏈球菌作為研究的對(duì)照，依據(jù)已有的研究[20]，我們可以推測，魚源、人及牛源的無乳鏈球菌可能具有共同的序列型別，但他們的PFGE型別可能存在較大的差異，因此他們可能存在宿主的選擇性，也即是表面抗原可能有所不同，但是，我們依然無法確定他們之間的傳播關(guān)系。進(jìn)一步的研究中，我們將開展這類研究并探討廣東地區(qū)感染羅非魚的無乳鏈球菌的可能來源，以期為羅非魚鏈球菌病害防控奠定基礎(chǔ)。

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Molecular epidemiology ofStreptococcusagalactiaein tilapia in Guangdong

FANGWei1,LIANGYuheng2,NINGDan3,KEBixia2,KEChangwen2,DENGXiaoling2,PENGHualin1,SUNJiufeng3,WANGXinyun1

(1．Guangdong Provincial Center for Aquatic Animal Disease Prevention and Control，Guangzhou 510222, China；2. Guangdong Provincial Center for Disease Prevention and Control, Guangzhou 511430, China；3. Guangdong Provincial Institute of Public Health, Guangdong Provincial Center for Disease Prevention and Control，Guangzhou 511430, China)

Tilapia samples were collected from five main tilapia farms in Guangdong. The characteristics of the isolates were determined by virulence gene detection, Multilocus Sequencing Type (MLST), and Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). The frequency of virulence gene in all isolates varied from 60.59% to 100%. Ten distribution patterns of virulence gene were identified, dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac (38.24%,65/170), dltr-bca-sodA-spb1-bac (23.53%，40/170), and dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB (22,35%,38/170) were the predominant patterns, followed by dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb (8.24%, 14/170) and dltr-bca-sodA-spb1 (4.71%, 8/170). The single allele was observed in each of seven loci, adhP(10), pheS(1), atr(2), glnA(1), sdhA(3), glcK(2), tkt(2)and result in unique ST 7 (Sequencing Type 7). One hundred and forty-six isolates were assigned to six clusters based on the PFGE results. The similarity between these clusters ranged from 86% to 100%. Cluster A (18), B (16), C (103) and D (7) were the predominant clusters, account for 98.63% of all isolates. Cluster A and C were distributed in all four areas, Cluster B were mainly isolated from Wuchuan, Maoming and Yangjiang, whereas Cluster D were isolated from Maoming, Zhuhai and Yangjiang. The unique clusters F and G were isolated from Maoming and Zhuhai, respectively. In addition, the clones in Clusters A--D isolated from different areas in Guangdong showed 100% similarity. High proportion of strains with virulence gene was observed inStreptococcusagalactiaestrains isolated from tilapia farm in Guandong. All of isolates belonged to the unique ST7. The clones with 100% similarity were identified in different area suggesting the cross infection and transmission in Guangdong, China.

tilapia;Streptococcusagalactiae; virulence gene; MLST; PFGE

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.018

2015-08-31

廣東省魚病專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(粵財(cái)農(nóng)〔2014〕89號(hào))

方偉(1982年生)，男；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖及養(yǎng)殖病害防治；通訊作者：王云新,孫九峰；E-mail:wfangshuichan@126.com,sunjiuf@163.com

Q78

A

0529-6579(2016)02-0097-06