米根霉脂肪酶的制備及其在餐廚廢棄油脂轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用*

姜蘇峻，林蔣海，呂曉靜，肖文娟，龔映雪，劉澤寰

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州510632)

米根霉脂肪酶的制備及其在餐廚廢棄油脂轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用*

姜蘇峻，林蔣海，呂曉靜，肖文娟，龔映雪，劉澤寰

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州510632)

利用脂肪酶把餐廚廢棄油脂轉(zhuǎn)化成為生物柴油能夠達(dá)到綠色化、資源化處理餐廚垃圾的目的。從米根霉CICC3005 cDNA文庫擴(kuò)增得到脂肪酶基因(proROL)，并克隆到畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPZαA中，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中構(gòu)建重組畢赤酵母，SDS-PAGE電泳發(fā)酵液上清，結(jié)果顯示重組酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為35 000。以橄欖油為底物測(cè)得脂肪酶活性為(426.6±0.8) U/mL。利用重組的米根霉脂肪酶對(duì)餐廚廢棄油脂進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，以乙醇為酰基受體制備脂肪酸乙酯，在水含量為5%，醇油摩爾比為4∶1，酶添加量為10%的條件下得到脂肪酸乙酯的最高得率為49%。

餐廚廢棄物；生物柴油；米根霉；脂肪酶；畢赤酵母

隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化建設(shè)步伐的日益加快，城市垃圾的產(chǎn)生量和危害也日益增加，其中尤以餐廚垃圾最為凸顯[1]。 “地溝油”就是從餐廚垃圾中的廢棄油脂提煉而來的。而且餐廚廢棄油脂占餐廚垃圾的比重還相當(dāng)?shù)母遊2]，如能合理利用，非但可以消除其對(duì)人們健康生活的危害，還能變廢為寶，生產(chǎn)大量的工業(yè)用油或生物柴油造福人類[3]。

利用餐廚廢棄油脂生產(chǎn)生物柴油目前多采用化學(xué)法[4]，化學(xué)法存在工藝復(fù)雜，醇消耗量大，污染環(huán)境等缺點(diǎn)。而酶法生產(chǎn)生物柴油具有操作簡(jiǎn)單，醇消耗量小，無污染物排放等優(yōu)點(diǎn)。但是傳統(tǒng)酶法工藝一般以毒性較大的甲醇為酰基受體，加工過程中仍然存在污染較大的隱患。

脂肪酶是一種能夠在油水界面起催化作用[5]，催化甘油三酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)[6]和酯化反應(yīng)[7]的特殊酯酶，在生產(chǎn)生物柴油、手性大分子以及表面活性劑[8]領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。因此通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)脂肪酶的外源高效表達(dá)對(duì)于合理利用餐廚廢棄油脂具有重要意義。米根霉來源的脂肪酶是一種比酶活較高的酯酶，在轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)方面有較好的表現(xiàn)[9]。該酶的編碼基因包括26個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列(presequence)，97個(gè)殘基的前導(dǎo)肽序列(prosequsence)和 269個(gè)氨基酸殘基的成熟肽序列(matureROL)，其中前導(dǎo)肽序列對(duì)脂肪酶的活性起到重要作用[10-11]。

本文從米根霉CICC3005菌株中克隆得到了脂肪酶基因，在畢赤酵母X-33中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，選取毒性較低的乙醇替代傳統(tǒng)?；荏w甲醇，以重組酵母生產(chǎn)的脂肪酶為催化劑進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油，從而達(dá)到降低催化劑的生產(chǎn)成本，減少對(duì)環(huán)境破壞的目的。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

載體pGAPZαA、大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli) DH5α 菌株、米根霉RhizopusoryzaeCICC 3005菌株。

畢赤酵母P.pastorisX33菌株由中國(guó)廣東省廣州市華南理工大學(xué)某實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

含有zeocin和Amp抗性的LB培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、含有zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基分別用以培養(yǎng)大腸桿菌、米根霉和酵母菌。

1.3 米根霉總RNA的提取以及cDNA文庫的構(gòu)建

米根霉總RNA的提取按照Invitrogen公司的TRIzol?Reagent說明書進(jìn)行操作；反轉(zhuǎn)錄與cDNA文庫的構(gòu)建按照ReverTra Ace-α-試劑盒說明書進(jìn)行。然后根據(jù)Genebank公布的米根霉基因序列(GenBank登錄號(hào)AF229435)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增脂肪酶基因，上游引物：5′-GAATTCGTTCCTGTTTCTGGTAAATC-3′;下游引物：5′-TCTAGAGCCAAACAGCTTCCTTCGTT-3′。

1.4 重組畢赤酵母的構(gòu)建與鑒定

將經(jīng)過測(cè)序的proROL序列克隆到pMD18-T中，得到pMD18-T-proROL。利用EcoR Ⅰ和XbaⅠ同時(shí)雙酶切pMD18-T-proROL和pGAPZαA載體，并在T4 DNA 連接酶作用下構(gòu)建pGAPZαA-proROL重組質(zhì)粒，用BlnⅠ線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33構(gòu)建重組菌，最后通過菌落PCR、SDS-PAGE和三丁酸甘油酯-維多利亞藍(lán)平板[12-13]鑒定陽性克隆并篩選高產(chǎn)菌株。

1.5 重組酵母發(fā)酵及酶活測(cè)定

將鑒定得到的重組酵母接種到含有zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后按照1%的接種量接種到含有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，用于重組酵母發(fā)酵以及酶活測(cè)定，在酶活最高點(diǎn)時(shí)收集粗酶液，凍干后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。脂肪酶酶活測(cè)定采用橄欖油乳化法[14]，脂肪酶酶活計(jì)算公式：

X1—脂肪酶酶活(U/mL)

V1—滴定樣品消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積(mL)

V2—滴定空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積(mL)

C—標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定液濃度(mol/L)

50—1 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉相當(dāng)于脂肪酸50 μmoL

n1—酶液稀釋倍數(shù)

0.05—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度

1/15—反應(yīng)時(shí)間為15 min，以1 min計(jì)。

1.6 脂肪酶酶學(xué)特性分析

脂肪酶酶學(xué)特性分析采用對(duì)硝基苯酚法[16-18]：配置10 mL 10 mmol/L的pNPC底物溶液：稱量24.23 μL pNPC溶于10 mL乙腈溶液。將以上底物溶液、乙醇、Tris-cl(pH 8.0)按照1∶4∶95(體積比)的比例混勻，然后取240 μL，加入適當(dāng)稀釋的酶液10 μL，于37 ℃水浴中準(zhǔn)確反映10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm下的吸光值，根據(jù)pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脂肪酶的pNP酶活。脂肪酶酶活定義為每分鐘釋放1 μmoL pNP所需要的酶量。分別研究了溫度、pH、有機(jī)溶劑，以及脂肪酶的底物特異性[18]。

1.7 油脂提取和以無水乙醇為?；荏w的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

首先通過索氏提取法提取餐廚廢棄物中的廢棄油脂[19]，測(cè)得餐廚廢棄油脂的酸值為(2.89±0.5) mg/g，皂化值為(199.94±0.8) mg/g，其平均摩爾質(zhì)量為(854.1±0.8) g/mol。然后將2 g餐廚廢棄油脂和不同醇油摩爾比下的無水乙醇在25 mL帶帽血清瓶中進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)：實(shí)驗(yàn)中采取3步(0，4，8 h)添加乙醇的方法來減少乙醇對(duì)脂肪酶酶活的損害。轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)溫度為40 ℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min。反應(yīng)結(jié)束后采用氣相色譜法計(jì)算生成生物柴油的量[20]。

2 結(jié)果和討論

2.1 重組畢赤酵母的構(gòu)建

用PCR方法擴(kuò)增得到RhizopusoryzaeCICC 3005的米根霉脂肪酶基因，連接T載后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示沒有發(fā)生突變。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，在1 100 bp處有明顯亮帶，表明成功克隆得到了米根霉脂肪酶基因，電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 米根霉RNA提取(A)和proROL(b)基因的擴(kuò)增Fig.1 RNA of Rhizopus oryzae(A)and proROL gene(B)

2.2 菌落PCR鑒定pGAPZαA-proROL陽性轉(zhuǎn)化子

從含有博來霉素抗性的YPD平板挑取8個(gè)單克隆做菌落PCR，如圖2所示。挑取1,2,11,12,13號(hào)單克隆進(jìn)行活化，4 ℃離心獲得粗酶液，取30 μL點(diǎn)到三丁酸甘油酯-維多利亞藍(lán)平板上觀察水解圈，13號(hào)水解圈最大，如圖3。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用13號(hào)重組子。

圖2 菌落PCR鑒定重組畢赤酵母Fig.2 Colony PCR of recombinant Pichia pastoris

圖3 三丁酸甘油酯-維多利亞藍(lán)平板水解圈Fig.3 Colour halos of Tributyrin-Victoria Blue

2.3 重組米根霉脂肪酶酶活曲線及生長(zhǎng)曲線

選取顯色平板中水解圈最大的13號(hào)重組子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并采用橄欖油乳化法測(cè)定重組脂肪酶酶活，在84 h(A600為30.0)的時(shí)候酶活達(dá)到最高值(426.6±0.8) U/mL，如圖4。對(duì)發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，顯示在理論值35 000附近存在明顯條帶，如圖5，表明米根霉脂肪酶在畢赤酵母中成功獲得了表達(dá)。

圖4 重組米根霉脂肪酶的酶活曲線及生長(zhǎng)曲線Fig.4 Time course analysis of recombinant proROL activities and biomass of recombinant Pichia pastoris

圖5 重組脂肪酶SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant lipase proROL

2.4 重組米根霉脂肪酶酶學(xué)特性分析

2.4.1 溫度和pH對(duì)重組脂肪酶的影響 如圖6和圖7所示，重組脂肪酶最適溫度和pH分別是30 ℃和pH 8.0,這與嚴(yán)翔翔[21]得出的結(jié)果一致。在溫度大于40 ℃后，酶活迅速下降，說明重組脂肪酶對(duì)溫度敏感。在pH 大于8.0后，酶活有所下降，但不明顯，表現(xiàn)出較強(qiáng)的pH耐受性。

圖6 溫度對(duì)重組脂肪酶的影響Fig.6 Influence of temperature on recombinant proROL

圖7 pH對(duì)重組脂肪酶的影響Fig.7 Influence of pH on recombinant proROL

2.4.2 有機(jī)溶劑對(duì)重組脂肪酶酶活的影響 從圖8可以看出，重組脂肪酶僅對(duì)甲醇、甲苯和正己烷有較好的耐受性，其相對(duì)酶活分別為87.70%、91.30%和89.40%?？紤]到后續(xù)實(shí)驗(yàn)以乙醇為酰基受體，我們又研究了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)脂肪酶酶活的影響。當(dāng)無水乙醇和脂肪酶粗酶液體積比為1∶9，即乙醇體積分?jǐn)?shù)約為4%時(shí)，對(duì)脂肪酶酶活的抑制作用較小，如圖9。

圖8 有機(jī)溶劑對(duì)重組脂肪酶的影響Fig.8 Influence of organic solvents on recombinant proROL

圖9 不同φ(乙醇)對(duì)重組脂肪酶的影響Fig.9 Influence of different concentrations of ethanol on recombinant proROL

2.4.3 proROL的底物特異性分析 從圖10可以看出，若設(shè)定圖10：14C底物與重組脂肪酶反應(yīng)時(shí)的酶活為100%，那么重組脂肪酶對(duì)圖10：8C底物的水解活性為85.20%，對(duì)圖10：8C-14C中長(zhǎng)度碳鏈底物表現(xiàn)出較好的水解活性，而對(duì)其他碳鏈長(zhǎng)度的底物水解活性較低。

圖10 重組脂肪酶底物特異性Fig.10 Substrate specificity of recombinant ProROL

2.5 以乙醇為酰基受體的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

2.5.1 水含量對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響 脂肪酶是一種在油水界面起催化作用的特殊酯酶，因此需要一定量的水分來輔助轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。從圖11可以看出，將脂肪酶凍干粉用于轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，在沒有水的情況下轉(zhuǎn)酯化效率很低，基本沒有脂肪酸乙酯的生成。當(dāng)水含量增加到5%時(shí)，轉(zhuǎn)酯化效率達(dá)到最高，此時(shí)脂肪酸乙酯得率為44%。繼續(xù)提高水含量，轉(zhuǎn)酯化效率隨之降低，這可能是由于過多的水存在時(shí)，脂肪酶水解活性增強(qiáng)，水解生成的脂肪酸乙酯，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。

圖11 水含量對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響Fig.11 Influence of water content on transesterification

2.5.2 醇油摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響 醇油摩爾比是影響轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的另一個(gè)重要因素。理論上，1 moL油脂需要3 moL乙醇來醇解，但往往總是需要更多的乙醇來保證反應(yīng)的充分進(jìn)行。如圖12，在醇油摩爾比為3∶1時(shí)，脂肪酸乙酯得率為40%；當(dāng)醇油摩爾比增加到增加到4∶1時(shí)，脂肪酸乙酯得率達(dá)到最高44%；繼續(xù)增加醇油摩爾比，脂肪酸乙酯得率有所下降，在醇油摩爾比為6∶1時(shí)，脂肪酸乙酯得率最高僅為21%，此時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)大于4%，過多的乙醇能抑制了脂肪酶酶活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率有所下降。

圖12 醇油摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響Fig.12 Influence of ethanol/oil molar ratio on transesterification

2.5.3 酶添加量對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響 在轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)過程中控制脂肪酶添加量能夠降低生物柴油的生產(chǎn)成本。如圖13，在醇油摩爾比為4∶1時(shí)，5%的酶添加量可以得到脂肪酸乙酯的得率為44%，當(dāng)酶量增加到10%時(shí)，脂肪酸乙酯得率最高僅為49%。繼續(xù)增加酶量到20%時(shí)，脂肪酸乙酯得率有所下降，這可能是由于過量酶粉降低了反應(yīng)體系的流動(dòng)性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率有所降低。

圖13 酶添加量對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響Fig.13 Influence of lipase amount on transesterification

3 結(jié) 論

本文嘗試建立一種低碳綠色的利用餐廚廢棄油脂制備生物柴油的新工藝。畢赤酵母中對(duì)米根霉脂肪酶實(shí)現(xiàn)了高效的分泌表達(dá)，重組脂肪酶酶活高達(dá)(426.6±0.8) U/mL，相比已報(bào)道的在大腸桿菌和釀酒酵母中表達(dá)的重組脂肪酶酶活有很大的優(yōu)勢(shì)[22]，進(jìn)一步降低了脂肪酶和后續(xù)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的成本，具有了工業(yè)化應(yīng)用的潛力。其次，我們?cè)诓捎铆h(huán)境友好的酶法制備生物柴油的同時(shí)，還選擇了毒性較低的乙醇替代甲醇作為?；荏w來制備生物柴油，并詳細(xì)研究了水含量、醇油摩爾比、酶添加量對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響，整體上實(shí)現(xiàn)了對(duì)餐廚廢棄油脂的綠色轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。

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Rhizopusoryzaelipase preparation and its application in the conversion of waste cooking oil

JIANGSujun,LINJianghai,LVXiaojing,XIAOWenjuan,GONGYingxue,LIUZehuan

(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632,China)

Using lipase to change waste cooking oil into biodiesel can achieve the goal of green, recycling of food waste. A gene encodingRhizopusoryzaelipase containing prosequence(ProROL) was cloned into the pGAPZαA and electrotransformed into thePichiapastorisX-33 strain. The lipase was functionally expressed and secreted with a molecular weight of 35 000. The lipase activity was (426.6±0.8) U/mL when using olive oil as substract. Using waste cooking oil as the raw material and alcohol as acyl receptor, lipase as catalyst for the production of fatty acid ethyl ester, 49% of the fatty acid ethyl ester yield was obtained when the water content is 5%, the alcohol oil molar ratio is 4∶1, and lipase adding amount is 10%, under this condition the fatty acid ethyl ester yield is 49%.

food waste; biodiesel;Rhizopusoryzae; lipase;Pichiapastoris

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.020

2015-04-07

姜蘇峻(1990年生)，男；研究方向：秸稈降解微生物的基因組和代謝工程；通訊作者：劉澤寰;E-mail:zhliu@jnu.edu.cn

Q815

A

0529-6579(2016)02-0111-06