基于線粒體D-loop基因的珠江翹嘴鲌遺傳多樣性與遺傳分化研究*

楊子拓，孫際佳，李桂峰，肖詩斌，張鶴千，

楊慧榮1,2，趙會宏1,2，劉 麗1,2

(1. 華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；2. 華南農業(yè)大學動物科學學院∥廣東省農業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東 廣州510642；3. 中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

基于線粒體D-loop基因的珠江翹嘴鲌遺傳多樣性與遺傳分化研究*

楊子拓1,2,3，孫際佳1,2，李桂峰3，肖詩斌1,2，張鶴千3，

楊慧榮1,2，趙會宏1,2，劉 麗1,2

(1. 華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；2. 華南農業(yè)大學動物科學學院∥廣東省農業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東 廣州510642；3. 中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

為探明分布于珠江流域的野生翹嘴鲌種群遺傳多樣性與遺傳分化狀況，實驗在珠江流域廣東省(肇慶和韶關)、廣西省(梧州、昭平、平樂、柳城、桂平、平果、田陽、龍州和扶綏)自然河流內采集野生翹嘴鲌種群。研究采用線粒體分子標記技術(D-loop基因)對珠江流域翹嘴鲌種群的遺傳多樣性做一個多方面的分析。利用PCR技術，得到D-loop全基因序列856 bp，通過分析發(fā)現(xiàn)，176個個體中合計41個單倍型；其單倍型多樣性指數(shù)(Hd= 0.875 06)和核苷酸多樣性指數(shù)(π= 0.007 00)顯示種群具有較高的遺傳多樣性。11個野生地理群體翹嘴鲌遺傳分化指數(shù)(FST)為0.188 28，顯示珠江流域翹嘴鲌作為一個大種群已產生了中度分化，種群分化時間經計算推斷為5萬年前左右。其中，梧州和桂平，梧州和肇慶，昭平和平樂，田陽和平果，扶綏和大部分種群(柳城、桂平、田陽、韶關)的遺傳分化程度都較低(FST<0.05)，基因流Nm>5；其他種群兩兩之間達中度遺傳分化(FST>0.05)，基因流Nm<5。分子系統(tǒng)樹和單倍型網絡關系顯示：單倍型Hap1和Hap2可能為單倍型先祖，其余單倍型由其進化而來。但遺傳距離與地理距離并沒有顯著相關性，種群擴散規(guī)律需要進一步探索，說明珠江流域野生翹嘴鲌并未地理因素產生種屬分化。

珠江流域；翹嘴鲌；D-loop；遺傳多樣性；遺傳分化

翹嘴鲌Culteralburnus屬鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae鲌亞科Culterinae鲌屬Culter，是鲌亞科中體型較大的魚類。翹嘴鲌的分布較廣、生態(tài)作用較大、營養(yǎng)和經濟價值較高，除在西部青藏高原少有分布外，廣泛分布于我國的各大水系[1]，翹嘴鲌的生態(tài)價值在于其能捕食水體中的小型魚類，保持水體生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[2]。但是近年來大規(guī)模捕撈導致自然種群中的翹嘴鲌資源下降，在1980年對巢湖中的翹嘴鲌種群進行資源調查發(fā)現(xiàn)，種群呈現(xiàn)嚴重的小型化和低齡化現(xiàn)象，種群結構嚴重不合理[3]，導致現(xiàn)今野生存活量較少。并且在翹嘴鲌人工養(yǎng)殖中沒有進行合理育種和繁殖，捕獲野生翹嘴鲌即進行育種[4]，導致種群質量衰退[5]，逃逸的魚類易破壞野生種群質量。一些研究還發(fā)現(xiàn)，長江中下游翹嘴鲌野生種群的的遺傳多樣性處于較低水平，親緣關系較近并且分化程度較小，其原因可能是環(huán)境與人為共同作用[6]；通過黑龍江、太湖、梁子湖等地采集的翹嘴鲌研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鲌種群在中國南北差異較大[7]。由于在珠江流域對翹嘴鲌的資源調查和遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)空缺，對野生魚類的遺傳多樣性數(shù)據(jù)并不充足[8-9]。因此急需展開此方面的調查，了解資源現(xiàn)狀對其利用和保護有重要意義。

線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)中的D-loop基因為非編碼蛋白序列，屬于線粒體基因序列的控制部分，該基因在群體遺傳學中利用較多[10-12]，是研究種內和種間關系的重要分子標記之一。因此，本實驗應用線粒體D-loop基因對珠江流域流經的廣西廣東省的野生翹嘴鲌遺傳多樣性和種群分化動態(tài)開展深入研究。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗中11個野生地理種群于2014 年7月至9月分別采集于廣西梧州(WZ)、昭平(ZP)、平樂(PL)、柳城(LC)、桂平(GP)、平果(PG)、田陽(TY)、龍州(LZ)和扶綏(FS)，廣東韶關(SG)和肇慶(ZQ)等自然珠江支流(樣本數(shù)量見表1)，樣本分別來自珠江流域的潯江(梧州)、桂江(昭平、平樂)、黔江(柳城)、郁江(桂平)、右江(平果、田陽)、左江(龍州、扶綏)、西江(肇慶)和北江(韶關)支流。取翹嘴鲌新鮮肌肉和鰭條于野外用φ=95%酒精固定保存。運回實驗室后，-20 ℃低溫冰箱保存。

1.2 DNA抽提與PCR及測序

基因組DNA的提取參考《分子克隆實驗指南》[13]的方法略加改進。以提取后的DNA為模板，利用線粒體DNA的D-loop區(qū)引物進行擴增，引物為DL1 (5′-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′)和DH2 (5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′)[14]。PCR反應總體積為50 μL，包括5 μL 10×PCR Buffer，4 μL 25 mmol / L MgCl2，1 μL 10 mmol / L dNTP，4 μL 2.5 mmol / L 雙向引物，0.4 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)，3 μL DNA模板。PCR 反應條件為94 ℃預變性2 min后，再進行35 個循環(huán)，每一循環(huán)包括: 94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min; 最后 72 ℃延伸 7 min。每次 PCR 反應均設不含模板DNA的空白對照。擴增產物經w=1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色，紫外燈光下檢測、拍照。PCR產物由中美泰和公司經切膠回收后測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測得序列用SeqMan[15]軟件進行比對，并輔以人工校對。使用DNAsp5.0[16]計算種群單倍型多樣性Hd、核苷酸多樣性π，用Arlequin 3.1.1 軟件[17]計算種群遺傳分化指數(shù)FST，種群間的基因流[18]由公式Nm=(1/FST-1)/4計算得出。并進行Tajima’s D中性檢驗(Neutrality tests)和單倍型間的分子方差分析(AMOVA)。利用該軟件計算種群起始擴張時間(τ)，通過公式t=τ/2uT(T為世代時間)來計算種群擴張的絕對時間。采用MEGA4.0[19]軟件分析堿基組成及苷酸位點的替換數(shù)，計算種群間和種群內Kumar 2-parameter 模型的遺傳距離，構建ML系統(tǒng)樹并對拓撲圖中的各個分支的支持率進行1 000 次自展法重抽樣檢驗。使用Network程序[20]基于Median Joining方法構建單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)生關系圖。

2 結果與分析

2.1 翹嘴鲌線粒體D-loop序列及單倍型

本實驗在11個種群176尾翹嘴鲌個體共獲取長度為856bp D-loop基因序列，分析得知該段序列中含115個變異位點(占總序列長度13.43%)，其中含59個簡約信息位點。各堿基含量平均值分別為：A=34.0%、T=31.8%、C=20.5%和G=13.7%。

在176條序列中共得41個單倍型序列(見表1)。通過轉換、顛換對遺傳距離可知: 轉換和顛換數(shù)沒有達到飽和狀態(tài)，且平均轉顛換(Ts/Tv)比值為5.24，證明該序列數(shù)據(jù)可進行下一步統(tǒng)計分析。在11個種群間，單倍型Hap1和Hap2由10個種群共享，單倍型Hap7、Hap9和Hap11都達到5個以上種群共享，單倍型Hap5、Hap6、Hap8、Hap13、Hap19和Hap24均有2個以上種群共享。經過重復擴增和測序后，確定發(fā)現(xiàn)其中WZ種群獨有Hap3和Hap4，PL種群獨有Hap10，LC種群獨有Hap12、Hap14-18、Hap20-22，GP種群獨有Hap25-27，PG種群獨有Hap28-31，TY種群獨有Hap32，F(xiàn)S種群獨有Hap33-36，SG種群獨有Hap37-39，ZQ種群獨有40-41，HY種群獨有Hap42。

表1 翹嘴鲌遺傳變異信息

2.2 種群遺傳多樣性及遺傳分化

2.2.1 種群遺傳多樣性 在表1中，11個地理種群的單倍型多樣性指數(shù)最小值0.634 0，最大值1.000 0；核苷酸多樣性指數(shù)π最小值0.000 4，最大值0.020 6，兩種多樣性指標都顯示出種群較大的變化幅度。TY種群π值為最小值0.000 4，ZQ種群為最大值0.020 6。由于部分樣本數(shù)量較少導致單倍型指數(shù)不穩(wěn)定原因，核苷酸多樣性指數(shù)表明了珠江流域翹嘴鲌的遺傳多樣性在不同地理種群的差距。

2.2.2 種群結構與遺傳分化 分子變異分析結果AMOVA見表2，可以看出，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(方差組分81.17%)。把所有種群作為一個整體時，總遺傳分化指數(shù)(FST=0.188 3，P<0.01 )，表明珠江流域翹嘴鲌已產生中度的遺傳分化。各種群翹嘴鲌的遺傳距離、遺傳分化指數(shù)和基因流見表3和表4。由表3可以得出各個種群翹嘴鲌之間遺傳距離差異較大，其中肇慶ZQ種群與昭平ZP種群的遺傳距離最大(0.020 1)，肇慶ZQ和平樂PL種群的遺傳距離(0.018 4)僅次于最大值，平果PG種群和田陽TY種群的遺傳距離最小(0.000 3)。遺傳距離表明種群間親緣關系，說明肇慶ZQ種群與昭平ZP、平樂PL種群之間親緣關系較遠。對于整個種群而言，最大值僅為0.020 1說明珠江流域的翹嘴鲌親緣關系并未發(fā)生大改變。

表2 珠江水系11個翹嘴鲌種群的分子方差分析結果

表3 珠江水系11個翹嘴鲌種群間遺傳距離

表4 珠江水系11個翹嘴鲌種群間的FST值(對角線下方)和Nm值(對角線上方)1)

1)**P<0.01, 差異極顯著;*P<0.05, 差異顯著

表4中可以看出，WZ與GP和ZQ分化不顯著，距離相近的TY和PG分化不顯著，F(xiàn)S與LC、GP、TY和SG分化不顯著，LZ與LC的分化不顯著(遺傳分化指數(shù)FST<0.25, 基因流Nm>5)。其余種群的兩兩組合均出現(xiàn)了顯著遺傳分化，特別是LZ種群與9個種群(除了LC)產生了極顯著的遺傳分化(FST大于0.05，基因流相對較低Nm<3.39)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關系分析

用MEGA 5.0 軟件的Maximum likelihood 法對11個種群翹嘴鲌mtDNA D-loop基因的41種單倍型構建系統(tǒng)發(fā)育樹并使用草魚CyprinusCarpioD-loop序列作為樹根得到圖1。由圖1得出，所有種群的單倍型呈鑲嵌式排列，沒有形成種群特異性進化枝。使用Network對翹嘴鲌單倍型進行網絡分析，經過人工簡化處理后如圖2，從整體上看，所有單倍型分為A、B、C三個小分支，A、B兩支單倍型關系較為接近，而C支大多通過假想單倍型相連。在A支以10個種群共享的單倍型Hap1和Hap2為中央單倍型，其他單倍型環(huán)繞在四周，形成星樣系統(tǒng)發(fā)生關系，說明種群由幾個單倍型進化而來。該圖像與蔡靜[21]網絡分析結果相似。

3 討 論

3.1 翹嘴鲌 D-loop 基因結構與遺傳多樣性分析

本研究沿珠江流域采集樣本，范圍遍布3個省份(廣東、廣西和貴州)11個城市，獲取共176個野生翹嘴鲌樣本，相對于漫長的分子進化速率和種群遷移時間，能反映當前部分野生資源的遺傳多樣性狀況。每個種群的樣本均在5尾及以上，采集樣本總數(shù)符合分析要求，采樣范圍廣泛，得到的結果有一定的實際指導意義。D-loop基因在線粒體DNA中的變異率最高，是線粒體DNA完整分子或是其他區(qū)域的5～10倍[22]，由于不編碼蛋白質，所以大部分基因變異不會對機體產生重大影響，因此可以在進化過程中通過母系遺傳保留下來，充分反映不同種群的進化方法。本研究中的翹嘴鲌樣本D-loop基因結果與哺乳動物[23]和爬行類[24]接近，符合脊椎動物線粒體DNA序列的組合特點[25]。

圖1 基于Maximum likelihood法的翹嘴鲌種群單倍型的分子系統(tǒng)樹(Hap1-42代表42個單倍型)Fig.1 The molecular phylogenetic tree of C.alburnus from different haplotypes in the Pearl River by ML method (Hap means different haplotypes)

圖2 41個 mtDNA D-loop 單倍型的進化網絡關系Fig.2 Median joining network of 41 mtDNA D-loop haplotypes

遺傳多樣性程度是生物多樣性的分子基礎，其大小決定了該生物能否繼續(xù)在生物圈繁衍和生活[26]，多樣性下降將會種群產生負面影響[27]。本次實驗所得的珠江流域翹嘴鲌核苷酸多樣性π=0.007，高于同水系中的光唇裂腹魚[28]，但低于同水系的赤眼鱒[29]，對比長江水系的翹嘴鲌種群[6]，本實驗中珠江水系的翹嘴鲌多樣性明顯較高。其中的原因可能有以下兩點：① 資源保護程度的差距。光唇裂腹魚為水域中下層小魚，在捕撈和養(yǎng)殖中皆不受重視，易被作為野、雜魚而失去經濟價值；赤眼鱒是全國優(yōu)質經濟魚類，育苗、繁殖、生長以及野生資源的保護都有較完備的體系，不同地理種群的資源調查都在進行中，投入的保護力度較大使得多樣性水平能保持較高水準。② 地理復雜性。雖然長江總面積為珠江4倍，流經的長度為珠江3倍，但是華南地區(qū)的山形地貌復雜，樣本所在的珠江水系內多為山地和丘陵，一旦魚群在某個生態(tài)系統(tǒng)內穩(wěn)定生存，易形成孤島與其他種群的交流降低，并根據(jù)不同的環(huán)境適應和進化，易獲得相對較高的多樣性。

Lan[30]的研究中表明π值低于0.005時，屬于低核苷酸型。本試驗中各地的核苷酸多樣性差距較大，梧州、桂平、平果、田陽、龍州和韶關皆低于0.002，昭平、平樂、柳城、扶綏和肇慶的π值都大于0.005。從核苷酸多樣性角度分析，盡管部分地區(qū)的種群處于低核苷酸的狀態(tài)，但整體翹嘴鲌樣本種群遺傳多樣性較高。造成該結果的原因推測是不同地理環(huán)境對翹嘴鲌種群造成的影響不同，一些π值偏低的種群，推測受到當?shù)厝藶楦蓴_如捕撈、挖沙和航運等產生變化。

本研究中11個種群翹嘴鲌的單倍型多樣性指數(shù)Hd變化范圍為0.634 0～1.000 0，平均值Hd=0.875 1。Nei[31]的研究認為當種群擁有較大數(shù)量，并且適應環(huán)境的種群不斷增多，才可以維持較高的單倍型多樣性。根據(jù)Grant分類[32]，以Hd=0.5，π=0.005為界，本實驗中梧州等6個種群(桂平、平果、田陽、龍州和韶關)屬于高單倍型和低核苷酸多樣性，推測這些種群經歷瓶頸效應[33]，由于受到環(huán)境的壓力或者人為災害如水體污染、水壩建設和過度捕撈而使得種群大量減少后，種群逐漸恢復但沒有積累足夠的核苷酸多樣性而出現(xiàn)此結果。這部分的種群若沒有受到保護很難抵御新一輪來自環(huán)境的壓力，容易造成種群數(shù)量大幅減少。通過種群起始擴張時間公式得出種群整體在5 000年左右產生遷移，根據(jù)史料記載2 000多年前，兩廣地區(qū)開始出現(xiàn)經濟和文化的傳播，至1 000年前我國北宋時期，才將兩廣地區(qū)收歸中央版圖，根據(jù)當時的生產力狀況推斷，人類對該地區(qū)的野生魚類開始初步產生影響。昭平等5個種群屬于高單倍型和高核苷酸多樣性，說明這些地點原本就擁有較大數(shù)量的種群，是維持高單倍型的基礎，并且并沒有受到環(huán)境壓力影響。綜合結果表明復雜的地理位置導致了樣本采集地區(qū)的翹嘴鲌遺傳多樣性的不穩(wěn)定性，需對遺傳多樣性較低的地區(qū)進行資源保護和管理。

3.2 翹嘴鲌種群的遺傳分化

從種群遺傳分化指數(shù) (FST) 和基因流 (Nm) 兩個方面對種群的遺傳分化進行評估。利用軟件Arlequin 得到11個種群兩兩之間的FST值。根據(jù)Wright研究[34]指出，當FST的值大于0.05，種群間屬于無遺傳分化；若FST小于0.15，則處于較小遺傳分化程度；若FST小于0.25，說明種群處于中度遺傳分化；若FST大于0.25，表示種群間有較大遺傳分化。本研究將珠江流域2個省份11個種群翹嘴鲌作為一個整體，通過AMOVA得出其FST為0.189 72 (P<0.05)，這說明將實驗采集的珠江流域翹嘴鲌作為一個大種群已產生了中度遺傳分化。與長江流域[6]、中國東南部翹嘴鲌[35]遺傳分化結果相似，與興凱湖、洪澤湖、洞庭湖等6野生種群翹嘴鲌線粒體ND2基因遺傳分化結果[36]和黑龍江、河南水庫、太湖等6個種群翹嘴鲌線粒體COII基因遺傳分化結果[37]不相同(其結果均顯示種群遺傳分化程度較大)。根據(jù)Slatkin對基因流研究說明，當Nm值大于5時，說明種群間能保持穩(wěn)定，有頻繁的基因交流[38]。從表5分析，梧州和桂平、肇慶，昭平和平樂，田陽和平果，扶綏和柳城、桂平、田陽、韶關之間分化不明顯。而其他種群之間產生高度的分化程度。值得注意的是，昭平與平樂種群之間的分化程度較低，但它們與其他種群卻產生了高度遺傳分化(FST>0.25)。其他種群之間也有中度分化現(xiàn)象，F(xiàn)ST在0.1～0.3之間。從地理上分布來看，平樂與昭平在東西方向有都龐嶺和大瑤山，與其他地方有明顯的地理隔離。而相比分化程度較低的梧州、肇慶和桂平3個種群，它們所處的3條支流黔江、潯江和西江互相連通，因此基因交流比較豐富；同樣的原因可用來解釋田陽與平果種群的低遺傳分化水平(均屬于右江支流)。

3.3 翹嘴鲌種群遺傳距離及親緣關系

遺傳距離的大小表明了種群之間親緣關系遠近，可以對種群之間的遺傳關系做出預測[39]。研究中11個種群的翹嘴鲌遺傳距離變異范圍為0.003 0～0.020 1，遺傳距離較小。根據(jù)Shaklee[40]研究發(fā)現(xiàn)，魚類的遺傳距離以0.9、0.3、0.05為界，區(qū)分為屬、種和種群三級水平。本研究中翹嘴鲌遺傳距離最高值仍低于0.05，未達亞種的分化指數(shù)。說明來自研究中來自11條不同水系的翹嘴鲌有可能為一支祖先種群繁衍而來。

由于個體數(shù)偏多，使用Maximum likelihood 法對所有個體作圖后，發(fā)現(xiàn)不同種群間個體互相參雜。故采用對種群單倍型進行Median-joining 和 ML 作圖。可看出，系統(tǒng)進化樹與單倍型網絡分析結果相似。單倍型Hap1和Hap2位于所有單倍型的中心，且這兩個單倍型是除平樂外所有種群所共享，兩種單倍型合計出現(xiàn)頻率達71次，推測為所有單倍型的祖先，其余單倍型由其逐漸發(fā)展而來。且單倍型間差異并不大，A、B兩支單倍型突變步驟不超過3次，說明各種群親緣關系并不遠。C支中的單倍型可能為各個種群中產生特異突變并保留下來的單倍型。

3.4 翹嘴鲌的保護管理

本研究所得的珠江流域所有翹嘴鲌種群作為一個整體來看，多樣性程度并不低，但不能因此就忽視對翹嘴鲌資源的保護，仍有大量采樣點的多樣性處于較低水平。對比其他遺傳多樣性研究且本研究為第一次對珠江流域野生翹嘴鲌種群進行多樣性檢測，尚不能確定是否已經因受到近年來人工捕撈和放流影響。需要結合后續(xù)對珠江和長江以及其他重要經濟流域的調查，開展詳細的研究工作，根據(jù)遺傳多樣性的變化趨勢采取相應的保護措施。本研究為中國翹嘴鲌資源調查補充更全面的數(shù)據(jù)，最終為翹嘴鲌野生資源提供保護和恢復，品種的選擇和可持續(xù)利用提供數(shù)據(jù)和理論基礎。

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Genetic diversity and genetic differentiation ofCulteralburnusfrom eleven geographical populations of the Pearl River based on mitochondrial D-loop gene

YANGZituo1,2,3,SUNJijia1,2,LIGuifeng3,XIAOShibin1,2,ZHANGHeqian3,YANGHuirong1,2,ZHAOHuihong1,2,LIULi1,2

(1. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2. College of Animal Science, South China Agricultural University∥Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-Animal Genomics and Molecular Breeding, Guangzhou 510642, China；3. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China )

Culteralburnusis one of the most economically important edible freshwater fish in the Pearl River and is widely distributed in the Yangtze River and the Yellow River. To assess the level of genetic diversity and genetic variation ofC.alburnuspopulations within the Pearl River，the samples were collected from the eleven geographical populations from Guangxi and Guangdong Province (Wuzhou, Zhaoping, Pingle, Liucheng, Guiping, Pingguo, Tianyang, Longzhou, Fusui). Among the 176 D-loop sequences, there were 286 polymorphic sites, including 115 variation sites and 59 parsimony informative sites. Overall, 41 haplotypes were defined among 176 Culter alburnus individuals.C.alburnuspopulations in the Pearl River were being a high haplotypic diversity index (Hd=0.875 06) and low nucleotide diversity index (π=0.007 00). The AMOVA (analysis of molecular variance) index of total populations was 0.188 28, indicating that the genetic differentiation among populations was moderate. It was predicted that differentiation time was about 50×103years.FSTindex between WZ and GP, WZ and ZQ, ZP and PL, TY and PG, especially, FS and LC, GP, TY, SG, was showed significant genetic differences (FST>0.25). The Phylogenetic tree and the Median joining drawing showed that haplotype 1 and 2 were the ancestors of other haplotypes. The relationship between genetic distance and geographical distance should be explored in the future.

The Pearl River;Culteralburnus; D-loop; genetic diversity; genetic differentiation

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.017

2015-08-31

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項資助項目(201303048)；國家科技基礎條件平臺建設項目(2008DKA30470-010)

楊子拓(1990年生)，男；研究方向：水生生物學；通訊作者：劉麗;E-mail:liuli@scau.edu.cn

S932.4

A

0529-6579(2016)02-0089-08