去甲斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

徐曉莉　王　欽　羅　佳

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇　南通　226001)

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去甲斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

徐曉莉王欽羅佳

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通226001)

〔摘要〕目的觀察去甲斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，探討其抗胃癌的作用機(jī)制。方法采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定不同濃度去甲斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的抑制率，其中實(shí)驗(yàn)組的去甲斑蝥酸鈉濃度分別為0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L，對照組不加去甲斑蝥酸鈉。采用流式細(xì)胞儀檢測SGC-7901細(xì)胞的增殖周期，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。結(jié)果濃度0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸鈉的實(shí)驗(yàn)組的OD值均低于對照組(t=2.871、5.295、10.100、13.836，P均<0.05)。隨著去甲斑蝥酸鈉濃度的提高，對SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨之增大。經(jīng)過流式細(xì)胞儀的檢測，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高(P<0.05)，而S期細(xì)胞比例和細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低(P<0.05)，均呈現(xiàn)出時(shí)間、濃度依賴性。結(jié)論去甲斑蝥酸鈉在體外可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，體現(xiàn)出抗癌活性，在胃癌治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

〔關(guān)鍵詞〕去甲斑蝥酸鈉；人胃癌SGC-7901細(xì)胞；抑制率；細(xì)胞增殖指數(shù)

尋找提高化療藥物對胃癌的療效，進(jìn)一步降低毒副反應(yīng)受到許多研究者的重視，而從中草藥中發(fā)現(xiàn)的一些抗腫瘤活性物質(zhì)已成為研究熱點(diǎn)。斑蝥素是從中藥斑蝥中提取出的抗腫瘤活性成分，對肝癌、胃癌、白血病等惡性腫瘤具有較好的療效，應(yīng)用后無骨髓抑制不良反應(yīng)，求有升高白細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，其細(xì)胞毒機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞的蛋白磷酸酶有關(guān)〔1,2〕。去甲斑蝥酸鈉是斑蝥素的半合成衍生物，可用作中晚期肝癌的臨床治療，并可增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，升高白細(xì)胞水平〔3～5〕。與斑蝥素比較，去甲斑蝥酸鈉的刺激性和毒性進(jìn)一步減少，并能顯著降低泌尿道不良反應(yīng)發(fā)生率。本文觀察去甲斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，探討其抗胃癌的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1細(xì)胞人胃癌SGC-7901細(xì)胞株，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院提供，用含10% 小牛血清RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h后取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25 %胰蛋白酶消化并接種傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2試劑與儀器去甲斑蝥酸鈉(北京萬輝藥業(yè)集團(tuán)公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司。Forma Steri-Cult 型紅外CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；DNM-9606型酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；IX83型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；BD FACS Calibur型全自動(dòng)多色分析流式細(xì)胞儀系統(tǒng)(美國Becton Dickinson公司)。

1.3藥物對細(xì)胞生長的抑制試驗(yàn)采用MTT法測定藥物對細(xì)胞生長的抑制率。將對數(shù)生長期人胃癌SGC-7901細(xì)胞株用培養(yǎng)基稀釋后置96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔的細(xì)胞濃度為1.0×104個(gè)/ml，置5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。吸去每個(gè)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，并加入用培養(yǎng)基稀釋為濃度0、0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸鈉200 μl，每個(gè)濃度均設(shè)置8個(gè)平行孔，并設(shè)置6個(gè)平行空白對照孔。置5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃繼續(xù)培養(yǎng)42 h，每孔中均加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后停止培養(yǎng)，吸去每孔的培養(yǎng)液，均加入150 μl二甲亞砜，將96孔板置于震蕩器中持續(xù)震蕩15 min使每孔成均勻的細(xì)胞混懸液。將96孔板置酶標(biāo)儀中在492 nm波長處測試每孔的光吸收值(OD值)。抑制率(%)=(1-加藥孔OD值/陰性對照孔OD值)×100%。

1.4細(xì)胞周期檢測分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集藥物作用后的各組細(xì)胞各1×106個(gè)，置離心機(jī)中1 500 r/min速度離心5 min，僅保留沉淀，采用PBS溶液洗滌沉淀3次，再加入溫度為4℃的70%乙醇溶液固定，置4℃冰箱中12 h。然后1 500 r/min速度離心5 min并棄去乙醇溶液，用PBS溶液洗滌混懸細(xì)胞，再采用直徑為400目篩網(wǎng)過濾，濾液離心后僅保留沉淀；加入RNaseA使?jié)舛葹?0 μg/ml，充分搖勻后保持37℃孵育30 min，再加入碘化丙啶使成終濃度50 μg/ml，保持4℃避光處理30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖周期，并按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=S+G2/M細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1去甲斑蝥酸鈉對SGC-7901細(xì)胞的抑制率濃度0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸鈉的實(shí)驗(yàn)組的OD值(0.54±0.10，0.40±0.12，0.24±0.09，0.15±0.07)均低于對照組(0.67±0.08，t=2.871、5.295、10.100、13.836，P均<0.05)。隨著去甲斑蝥酸鈉濃度的提高，對SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨之增大(0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸鈉組分別為(19.40±5.73)%、(40.30±8.56)%、(64.18±9.10)%、(77.61±9.98)%。

2.2SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期和PI經(jīng)過流式細(xì)胞儀的檢測，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而S期細(xì)胞比例和PI明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均呈現(xiàn)出時(shí)間、濃度依賴性。SGC-7901細(xì)胞的G0/G1、S期細(xì)胞比例和PI見表1。

表1　SGC-7901細(xì)胞的G0/G1、S期細(xì)胞比例和

與對照組比較：1)P<0.05；與同濃度組前一時(shí)間點(diǎn)比較：2)P<0.05；與同時(shí)間點(diǎn)前一濃度組比較：3)P<0.05

3討論

斑蝥是昆蟲綱鞘翅目芫菁科南方大斑蝥與黃黑小斑蝥的干燥蟲體，是傳統(tǒng)昆蟲類中藥，有劇毒，其主要有效成分為斑蝥素。近年來的研究通過人工改造化學(xué)結(jié)構(gòu)的方法，合成了一些斑蝥素的衍生物，主要有：去甲斑蝥素、甲基斑蝥胺、斑蝥酸鈉、羥基斑蝥胺等〔6,7〕。以上衍生物與斑蝥素相比，毒性顯著下降，且均具有抗腫瘤活性〔8～11〕。去甲斑蝥素和氫氧化鈉共熱后的水解產(chǎn)物去甲斑蝥酸鈉，同樣保留了斑蝥素的抗腫瘤藥理作用，且毒副反應(yīng)低于斑蝥素。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的去甲斑蝥酸鈉作用48 h后，SGC-7901細(xì)胞的生長出現(xiàn)不同程度的抑制作用，且隨去甲斑蝥酸鈉濃度的提高，對SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨之增大，表明去甲斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有明確的細(xì)胞毒作用，體現(xiàn)出顯著的體外抗癌活性，且這種細(xì)胞毒作用具有濃度依賴性。

胃惡性腫瘤細(xì)胞的增殖周期可分為G1/G0期、S期、G2期和M期。其中，S期是SGC-7901細(xì)胞的DNA合成期，在細(xì)胞的惡性增殖過程中發(fā)揮主要作用，因而惡性腫瘤細(xì)胞的S期比例越高，其增殖越快，腫瘤細(xì)胞的倍增時(shí)間越短〔12〕。惡性腫瘤細(xì)胞的增殖活性通常用PI表示，其數(shù)值越大表明腫瘤細(xì)胞增殖越旺盛〔13〕。本文結(jié)果表明去甲斑蝥酸鈉在體外可將SGC-7901細(xì)胞有效停滯在G1/G0期，進(jìn)入S期的腫瘤細(xì)胞比例明顯減少，從而抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，在細(xì)胞周期的角度解釋了去甲斑蝥酸鈉的體外抗胃癌活性。

早期胃癌患者多為老年人群，往往并未表現(xiàn)出典型的臨床表現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)典型表現(xiàn)時(shí)患者大多已喪失給予傳統(tǒng)化學(xué)治療的時(shí)機(jī)〔14〕。胃癌的發(fā)生和進(jìn)展與腫瘤細(xì)胞的過度增殖和凋亡減緩密切相關(guān)，當(dāng)胃癌細(xì)胞的凋亡與增殖過程失去平衡后，胃癌將會迅速進(jìn)展和擴(kuò)散〔15〕。因此，選擇合適的抗胃癌藥物，必須從抑制胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡方面著手。去甲斑蝥酸鈉作為一種中藥有效成分的半合成衍生物，可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，體現(xiàn)其在胃癌治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

第一作者：徐曉莉(1970-)，女，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。

〔中圖分類號〕R735.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2074-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.011