活性氧調控可溶性環(huán)氧化物水解酶表達增高在門靜脈高壓癥大鼠體內的實驗研究

施丹麗，秦駿，何越，羅蒙

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院 普通外科，上海 201999；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 普通外科，上海 200011；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 普通外科，上海 200127）

?

活性氧調控可溶性環(huán)氧化物水解酶表達增高在門靜脈高壓癥大鼠體內的實驗研究

施丹麗1，秦駿2，何越2，羅蒙3

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院 普通外科，上海 201999；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 普通外科，上海 200011；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 普通外科，上海 200127）

［摘 要］目的 明確活性氧（reactive oxygen species，ROS）是否可在肝硬化門靜脈高壓癥大鼠肝外環(huán)境中調控可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）表達，驗證sEH對這一疾病模型腸系膜血管中肌源性反應的影響。方法 利用多道生物分析儀分別測定正常對照組大鼠、實驗對照組大鼠（四氯化碳處理）及NAPDH抑制劑夾竹桃麻素（apocynin，Apo）干預的處理組大鼠門靜脈壓力；免疫印跡分析3組大鼠腸系膜動脈組織sEH、ROCK及p-moesin蛋白表達水平的變化；血管灌流系統(tǒng)測定各組大鼠腸系膜動脈血管的肌源性反應。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果 （1）正常對照組、實驗對照組和Apo處理組大鼠平均門靜脈壓力分別為（6.5±0.9）mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）、（15.9± 1.6）mmHg和（10.6±1.2）mm Hg，肝硬化門靜脈高壓癥大鼠經Apo處理后，門靜脈壓力顯著降低（P＜0.05）。（2）與正常對照組比較，實驗對照組大鼠腸系膜組織sEH蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05），p-moesin表達顯著降低（P＜0.01），但Apo處理組sEH蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），p-moesin表達回復，但仍與正常對照組存在顯著差異（P＜0.05）。（3）肌源性收縮在實驗對照組大鼠顯著降低（P＜0.05），經過Apo干預后，肌源性收縮改善，血管恢復收縮活性。結論 四氯化碳致肝硬化門靜脈高壓癥大鼠肝外環(huán)境sEH表達增高，與活性氧含量相關。使用NAPDH特異性抑制劑去除活性氧后，sEH表達減低，血管肌源性反應恢復，提示在肝硬化門靜脈高壓癥中限制sEH作用可作為緩解氧化應激外的另一治療方向。

［關鍵詞］肝硬化；高血壓，門靜脈；可溶性環(huán)氧化物水解酶；肌源性反應；大鼠

肝硬化門靜脈高壓癥除肝內明顯的肝纖維化作為該疾病的顯著特征外，在肝外部分表現(xiàn)為全身高動力循環(huán)及氧化應激水平升高［1］。因肝內肝纖維化形成這一病理過程不可逆，因此改善肝外環(huán)境、緩解高動力循環(huán)從而降低門靜脈壓力正成為近年研究的重點。多項研究表明：某些疾?。ㄌ悄虿?、高血壓等）可使機體處于氧化應激狀態(tài)的，同時機體sEH表達水平均增高［2-3］，提示其在肝硬化門靜脈高壓癥肝外也有增高的可能。另一方面，前研究已證實活性氧（reactive oxygen species，ROS）與門靜脈高壓癥內臟血管收縮功能受損有關［4］，但其具體機制仍處在探索階段，抑制sEH可顯著緩解高血壓和肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展［5］，提示將其作為治療靶點也有改善肝硬化門靜脈高壓癥血管肌源性反應的可能。夾竹桃麻素（apocynin，Apo）為NADPH特異性抑制劑，可顯著降低機體內活性氧的產生。ROCK以及p-moesin為常見的血管肌源性反應蛋白標記物［4］，其表達水平降低則表明血管收縮反應性降低。本實驗采用四氯化碳誘導肝硬化門靜脈高壓癥大鼠模型，采用Apo干預抑制活性氧的產生，從而探討sEH蛋白表達與門靜脈高壓癥全身高氧化應激狀態(tài)之間的聯(lián)系，并檢測血管肌源性反應活性相關蛋白，從而為臨床通過肝外途徑降低門靜脈壓力提供新的思路及理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1動物與試劑

體重為120～150 g雄性SD大鼠14只，由上海交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。NADPH抑制劑Apo購自美國Santa Cruz公司。兔抗sEH單克隆抗體，兔抗ROCK單克隆抗體以及兔抗p-moesin單克隆抗體購自美國Abcam公司?？雇每贵w購自美國Cell Signaling Technology公司。RIPA裂解液，SDS上樣緩沖液購自中國碧云天公司。蛋白酶抑制劑購自美國Roche公司。蛋白定量試劑購自美國Bio-Rad公司。血管灌流系統(tǒng)由美國紐約醫(yī)學院生理教研室提供。

1.2動物模型制備與分組

根據(jù)文獻［6］制備肝硬化門靜脈高壓癥SD大鼠模型。正常組4只：雄性SD大鼠生理鹽水4 μL/g肌肉注射，每周2次，共16周。實驗對照組5只：雄性SD大鼠60%四氯化碳油溶液4 μL/g肌肉注射，每周2次，同時飲5%乙醇，共16周。Apo處理組5只：四氯化碳注射同實驗對照組，自造模開始第12周，每日腹腔注射Apo 30 mg/kg。

1.3門靜脈壓力測定

大鼠停止注射四氯化碳或生理鹽水1周后，禁食1 d，進行門靜脈壓力測定。腹腔注射3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液2 mL/kg進行麻醉，沿腹正中線作切口，暴露門靜脈及其小腸系膜血管分支，18-GA導管肝素化后一端穿刺進入小腸系膜血管，并沿血管管腔將導管緩慢送入門靜脈管腔中并固定。將18-GA導管另一端與多道生物換能器連接，平衡10 min數(shù)值穩(wěn)定后，測得數(shù)值即為門靜脈壓力。

1.4免疫印記法檢測蛋白表達

門靜脈壓力測定完成后，將大鼠腸系膜組織取出，4 ℃磷酸鹽緩沖溶液中洗凈后立即放入液氮中，后置于-80 ℃冰箱中保存。應用免疫印跡法檢測腸系膜組織sEH，ROCK及p-moesin的表達。并用GAPDH作為內參照，采用美國Fusion公司數(shù)碼成像分析系統(tǒng)對免疫印記結果進行定量分析。ROCK及p-moesin為公認的血管收縮功能相關蛋白，其在組織中表達情況可檢測血管功能狀態(tài)。

1.5血管灌流裝置檢測腸系膜動脈肌源性反應

測定門靜脈壓力后，切除腸系膜上動脈及相連腸系膜和腸管，置入MOPS生理緩沖液（0～4 ℃，pH= 7.4）中保存用于分離第3級微動脈。解剖顯微鏡下，在含有MOPS的血管分離槽內，銳性分離得到第三級腸系膜微動脈。將分離得到的腸系膜微動脈轉移到含有PSS的血管灌流系統(tǒng)血管槽內，將玻璃微管（含有PSS頂端直徑約50 μm）插人微動脈管腔的一端，并用11-0單股線結扎固定，以80 mmHg的灌注壓沖洗出血管腔內的血液，并維持血管另一端的開放。然后，將另一玻璃微管插入血管管腔的另一端，同樣以11-0線結扎固定。血管直徑通過顯微鏡攝像系統(tǒng)顯示于計算機顯示屏上，其變化通過微動脈顯像尺測定。血管在80 mmHg的管內壓下，穩(wěn)定30 min，記錄基礎狀態(tài)的直徑，并依次加大血管管腔內壓力，分別記錄不同壓力下血管的收縮性，以收縮率（血管內徑改變量占血管基礎狀態(tài)直徑的百分比）為量化標準，繪制壓力-收縮曲線。以收縮率作為縱坐標，以管腔內壓力作為橫坐標。

1.6統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1大鼠門靜脈壓力檢測

正常對照組、實驗對照組和Apo處理組大鼠平均門靜脈壓力分別為（6.5±0.9）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、（15.9±1.6）mmHg和（10.6±1.2）mmHg，肝硬化門靜脈高壓癥大鼠經Apo處理后，門靜脈壓力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　三組大鼠門靜脈壓力變化

2.2大鼠腸系膜血管組織sEH蛋白表達變化

使用免疫印記法檢測大鼠腸系膜組織中sEH蛋白表達變化。免疫印記法檢測大鼠腸系膜組織sEH表達變化：與正常對照組比較，實驗對照組大鼠腸系膜動脈sEH蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05），Apo處理后，sEH蛋白表達顯著降低（P＜0.05），但仍高于正常對照組（P＜0.05）。見圖2。

2.3血管功能相關蛋白表達變化

Western blotting檢測3組大鼠腸系膜動脈組織中ROCK及p-moesin蛋白表達水平的變化情況。（1）ROCK蛋白表達水平的變化：三組大鼠ROCK蛋白無明顯變化，與前研究相吻合。（2）p-moesin蛋白表達水平的變化：與正常對照組比較，實驗對照組大鼠腸系膜組織p-moesin蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Apo處理組蛋白表達水平雖較實驗對照組顯著升高（P ＜0.05），但仍低于正常對照組（P＜0.05），提示血管收縮功能部分恢復。見圖3。

圖2　三組sEH蛋白表達變化圖

2.4三組大鼠肌源性反應

采用血管灌流系統(tǒng)檢測3組大鼠腸系膜3級動脈的肌源性收縮，與正常對照組大鼠相比，肝硬化門靜脈高壓癥大鼠肌源性反應均顯著減弱（P＜0.05）；使用NADPH抑制劑后，肌源性反應恢復（P＜0.05）。結果見圖4。

3　討論

在肝硬化門靜脈高壓癥大鼠體內，氧化應激水平是增高的［7］，表明有高于正常生理量的活性氧存在于機體內，但其在該疾病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用仍未探明。已有研究證實，過量的活性氧如過氧化氫在門脈系統(tǒng)內，可導致側支循環(huán)產生，引起靜脈曲張破裂等嚴重并發(fā)癥［8］，在肝外，可導致血管對縮血管物質的低反應性，導致內臟血管擴張，門靜脈灌注增多，最終促進門靜脈高壓癥的發(fā)生。本實驗采用的NADPH抑制劑Apo，在之前其他疾病模型的研究中已證實可顯著降低機體組織氧化應激水平，因此可以認為本實驗中Apo治療組大鼠機體氧化應激水平是降低的。

sEH可降解多種具有抗炎、抗氧化應激的脂類物質［10］，提示其在氧化應激相關疾病發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要作用，在高血壓及糖尿病等動物疾病模型的研究中，抑制sEH可顯著改善機體微血管功能［2-3］，從而為相關疾病的治療提供新的思路。我們的研究發(fā)現(xiàn)，sEH蛋白表達水平在肝硬化門靜脈大鼠腸系膜微動脈顯著升高，通過抑制NADPH活性后sEH蛋白表達水平降低，可以證明sEH在肝硬化門靜脈高壓癥機體的高表達與氧化應激水平相關，且通過檢測肌源性反應，證實活性氧可直接導致血管收縮功能受損，這一發(fā)現(xiàn)很好地完善了我們之前的研究結果［4］，證實了氧化應激狀態(tài)不僅會造成血管對縮血管物質的反應性減弱，其自身舒縮調節(jié)也會受到損害，為該疾病中活性氧的認識提供了新的視角和思考方向。

圖3　三組血管功能相關蛋白表達變化圖

圖4　三組大鼠腸系膜動脈肌源性反應

在之后的研究中，我們將采用特異性sEH抑制劑，觀察其是否具有與Apo類似的作用?？紤]到活性氧在正常生理條件下為重要的細胞內第二信使，單純地抑制其在門靜脈高壓癥機體內的產生缺乏可靠的臨床依據(jù)，而sEH已證實確與血管舒縮功能相關［11］，且其特異性抑制劑已進入臨床試驗，若可在肝硬化門靜脈高壓癥中也得到證實，則對該疾病治療方式的發(fā)展有顯著的開拓作用，具有深刻的實際意義。

參考文獻：

［1］ MARUYAMA H， YOKOSUKA O. Pathophysiology of portal hypertension and esophageal varices ［J］. Int J Hepatol， 2012，2012: 895787-895787.

［2］ LEE G-H， BHANDARY B， LEE E-M， et al. The roles of er stress and p450 2e1 in ccl4-induced steatosis ［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2011， 43（10）: 1469-1482.

［3］ PANIGRAHY D， KALISH B T， HUANG S， et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration ［J］. P Natl Acad Sci USA， 2013， 110（33）: 13528-13533.

［4］ CHEN W， LIU D-J， HUO Y-M， et al. Reactive oxygen species are involved in regulating hypocontractility of mesenteric artery to norepinephrine in cirrhotic rats with portal hypertension ［J］. Int J Biol Sci， 2014， 10（4）: 386-395.

［5］ QIN J， SUN D， JIANG H， et al. Inhibition of soluble epoxide hydrolase increases coronary perfusion in mice ［J］. Physiol Rep， 2015， 3（6）， pil: e12427.

［6］ 羅蒙， 陳煒， 秦駿， 等. 一氧化氮降低肝硬化門靜脈高壓癥血管收縮反應性的實驗研究 ［J］. 中華消化外科雜志， 2013，12（3）： 222-227.

［7］ KISSELEVA T， BRENNER D A. Mechanisms of fibrogenesis ［J］. Exp Biol Med， 2008， 233（2）: 109-122.

［8］ 段明， 何越， 陳煒， 等. 過氧化氫在門靜脈高壓癥大鼠側支循環(huán)建立中的作用 ［J］. 肝膽胰外科雜志， 2015， 27（1）： 22 -25.

［9］ ANGERMAYR B， MEJIAS M， GRACIA-SANCHO J， et al. Heme oxygenase attenuates oxidative stress and inflammation， and increases vegf expression in portal hypertensive rats ［J］. J Hepatol， 2006， 44（6）: 1033-1039.

［10］ STABLES M J， GILROY D W. Old and new generation lipid mediators in acute inflammation and resolution ［J］. Prog Lipid Res， 2011， 50（1）: 35-51.

［11］ SIRISH P， LI N， LIU J-Y， et al. Unique mechanistic insights into the beneficial effects of soluble epoxide hydrolase inhibitors in the prevention of cardiac fibrosis ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013， 110（14）: 5618-5623.

（本文編輯：魯翠濤）

·論著 基礎研究·

Experiment on ROS-induced soluble epoxide hydrolase in rats with portal hypertension

SHI Dan -li1， QIN Jun2， HE Yue2， LUO Meng3.1Department of General Surgery， Shanghai 3rdPeople’s Hospital Affiliated to School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201999， China；2Department of General Surgery， Renji Hospital Affiliated to School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200011， China；3Department of General Surgery， the 9thPeople’s Hospital Affiliated to School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200127， China

AbstractObjective To investigate the mechanism of reactive oxygen species （ROS） in the regulation of soluble epoxide hydrolase （sEH） in portal hypertensive rats， and to verify the influence of sEH on myogenic response. Methods Portal pressure was measured in normal rats group， carbon tetrachloride treated rats group，as well as rats group treated with NAPDH inhibitor. The protein expression levels of sEH， ROCK and p-moesin in mesenteric arteries tissues of rats in 3 groups were determined by Western-blotting. Myogenic response was detected by vascular perfusion system. All data was analyzed by variance or LSD-t test. Results （1）The portal pressures of the normal control group， experimental control group and Apo-treated group were （6.5±0.9） mmHg，（15.9±1.6） mmHg and （10.6±1.2） mmHg， respectively， with a significant difference among the 3 groups （F=96.5，P＜0.05）. （2）Compared with the normal control group， the protein expression level of sEH in mesenteric arteries of the experimental control group was significantly increased （P＜0.05）， while it decreased in the Apo-treated group （P＜0.05）. （3）The myogenic response in portal hypertensive rats was attenuated significantly and revivedbook=198,ebook=27after Apo treatment. Conclusion Apo can reduce the sEH levels in the mesenteric arteries， which suggests that sEH is regulated by ROS. Down-expression of sEH can be the future aim to cure the damaged myogenic response in portal hypertension.

Key wordsliver cirrhosis； portal hypertension； soluble epoxide hydrolase； myogenic response； rats

［通訊作者簡介］羅蒙，主任醫(yī)師，博士，E-mail：luotysy@sina.com。

［第一作者簡介］施丹麗（1981-），女，上海人，主治醫(yī)師。

［基金項目］國家自然科學基金項目（81370548）。

［收稿日期］2015-11-25

［中圖分類號］R657.3+4

［文獻標識碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.006