動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展*

喻才正，　周　婷，　黃　倩，　周　爽

武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢　430065

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綜述

動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展*

喻才正，周婷△，黃倩，周爽

武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢430065

關(guān)鍵詞：變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎；替代試驗(yàn)；接觸性致敏物

人們?cè)谌粘Ｉ罨蚬ぷ髦衅つw經(jīng)常會(huì)接觸各種外源性化合物(化妝品、染發(fā)劑、橡膠制品等)，長期反復(fù)接觸這類化學(xué)物質(zhì)很可能會(huì)導(dǎo)致皮膚發(fā)生過敏反應(yīng)，出現(xiàn)瘙癢、紅斑、丘疹、水腫甚至潰瘍等臨床特征的變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)。ACD是個(gè)體皮膚或黏膜接觸變應(yīng)原后，變應(yīng)原與表皮細(xì)胞蛋白結(jié)合形成具有致敏性的復(fù)合物，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生以T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性組織損傷的疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，西方國家15%～20%的人群(全世界約有1%人口)至少會(huì)對(duì)一種過敏原(如金屬類物質(zhì)、染色劑、防腐劑以及化妝品和橡膠中的某些有機(jī)化合物)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎已成為一種主要的職業(yè)性皮膚病[1-4]。目前，ACD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，臨床上也無完全治愈的方法，通常使用皮質(zhì)類固醇對(duì)癥治療。因此，為了降低ACD的發(fā)病率，采用簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法分析化學(xué)物的皮膚致敏性，早期采取有效的防護(hù)措施，對(duì)保護(hù)人群健康具有重要的指導(dǎo)作用。一般通過試驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)接觸受試物后出現(xiàn)的過敏反應(yīng)預(yù)測(cè)人群接觸該物質(zhì)后是否出現(xiàn)過敏反應(yīng)及出現(xiàn)過敏反應(yīng)的程度，因此，本文就動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展作一綜述。

動(dòng)物的皮膚致敏試驗(yàn)可分為整體動(dòng)物試驗(yàn)、體內(nèi)替代試驗(yàn)、體外替代試驗(yàn)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及大量新型化學(xué)物品的上市，生產(chǎn)者和消費(fèi)者將會(huì)接觸到更多具有潛在致敏性的化學(xué)物品。近年來，隨著動(dòng)物福利原則和“3R”即減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)原則的推進(jìn)，體外評(píng)價(jià)化學(xué)物潛在致敏性的方法也逐漸受到人們的廣泛關(guān)注[5-8]。

1整體動(dòng)物試驗(yàn)

檢測(cè)化學(xué)物皮膚致敏性的整體動(dòng)物試驗(yàn)方法包括豚鼠最大值試驗(yàn)(guinea pig maximization test，GPMT)和局部封閉涂皮試驗(yàn)(buehler test，BT)。GPMT使用弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA)作為免疫增強(qiáng)劑，試驗(yàn)包括皮內(nèi)注射、局部接觸誘導(dǎo)和激發(fā)封閉斑貼3個(gè)過程。而BT法不使用佐劑，只需在誘導(dǎo)期和激發(fā)期對(duì)局部皮膚涂抹受試物。根據(jù)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)皮膚反應(yīng)評(píng)分準(zhǔn)則對(duì)豚鼠進(jìn)行評(píng)分，從而確定出現(xiàn)陽性反應(yīng)的豚鼠數(shù)量并計(jì)算致敏度(陽性反應(yīng)豚鼠數(shù)占各組豚鼠總數(shù)百分比)，當(dāng)致敏度≤28%時(shí)判斷為非致敏物，反之為致敏物。由于BT法沒有使用弗氏完全佐劑免疫增強(qiáng)劑來刺激免疫系統(tǒng)，該方法的靈敏度比GPMT低[9]。GPMT法篩選弱致敏原的能力較強(qiáng)，但佐劑的使用可能會(huì)過高地估計(jì)受試物的致敏潛力；而BT法能夠較準(zhǔn)確地檢測(cè)出中度至重度的致敏物。

整體動(dòng)物試驗(yàn)的最大優(yōu)點(diǎn)是對(duì)致敏物的敏感性強(qiáng)，但需要的動(dòng)物數(shù)量較多、試驗(yàn)周期長，如果試驗(yàn)結(jié)果難以確定，還需增加動(dòng)物只數(shù)，且試驗(yàn)結(jié)果是通過觀察豚鼠皮膚出現(xiàn)紅斑和水腫的反應(yīng)及其程度對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，易受觀察個(gè)體主觀因素的影響。此外，該類方法無法鑒定一些能使動(dòng)物皮膚染色的化學(xué)品(如染料、色素)的致敏性。

2體內(nèi)替代試驗(yàn)

體內(nèi)替代試驗(yàn)是用小鼠代替豚鼠的試驗(yàn)方法，包括鼠耳廓腫脹試驗(yàn)(mouse ear swelling test，MEST)、非侵入性鼠耳廓腫脹分析法(noninvasive mouse ear swelling assay，MESA)和局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(local lymph node assay，LLNA)。與整體動(dòng)物試驗(yàn)相比，體內(nèi)替代試驗(yàn)明顯減少了試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量；并以體積小的動(dòng)物代替體積大的動(dòng)物，減少了實(shí)驗(yàn)室的使用面積和耗能，改進(jìn)了試驗(yàn)結(jié)果的測(cè)量方法，使結(jié)果更客觀，實(shí)現(xiàn)了減少和優(yōu)化原則。目前，美國食品和藥品管理局以及經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)將LLNA方法收錄在新的致敏試驗(yàn)指南中[10-11]。

2.1鼠耳廓腫脹試驗(yàn)(MEST)和非侵入性鼠耳廓腫脹分析法(MESA)

MEST方法是預(yù)先向小鼠腹部皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑，再用膠帶剝脫法多次剝離腹部皮膚角質(zhì)層后涂受試物，然后連續(xù)3 d將受試物敷于脫毛部位中央，7 d后將受試物涂于一側(cè)耳廓，測(cè)量涂藥前后24、48 h小鼠耳廓厚度的變化，鼠耳廓腫脹厚度超過20%者判為致敏物[12]。該方法具有耗資低、試驗(yàn)周期短、評(píng)分客觀、排除受試物顏色的干擾等優(yōu)點(diǎn)，可定量分析化學(xué)物質(zhì)引起的遲發(fā)性接觸超敏反應(yīng)的程度，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于光毒反應(yīng)、光敏反應(yīng)的研究中。但該方法靈敏度較低，一般只適合作為篩選，陰性結(jié)果的化學(xué)物仍需其它試驗(yàn)方法加以確認(rèn)。

MESA與MEST的基本方法相似，也是通過測(cè)量小鼠耳部的腫脹程度評(píng)估受試物致敏潛能。但MESA法不需要進(jìn)行小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐劑、破壞腹部皮膚的角質(zhì)層屏障等步驟，減少了侵入性操作。若給予小鼠高維生素A飲食時(shí)，MESA法的小鼠致敏反應(yīng)強(qiáng)度可放大數(shù)倍，可用于檢測(cè)極低濃度的已知致敏物導(dǎo)致接觸性致敏性皮炎的潛能，其靈敏度高于人體試驗(yàn)，與豚鼠試驗(yàn)相當(dāng)[13-14]。

2.2小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)

LLNA試驗(yàn)的基本方法是連續(xù)3 d在小鼠兩耳背上涂抹適當(dāng)濃度的受試物進(jìn)行誘導(dǎo)，末次誘導(dǎo)后第3天將放射性同位素標(biāo)記的胸苷注射入小鼠尾靜脈。通常以橄欖油作為對(duì)照組進(jìn)行同樣處理，5 h后處死動(dòng)物，切下兩耳旁的淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液，測(cè)量細(xì)胞每分鐘分裂數(shù)[10，15]。由于皮膚變態(tài)反應(yīng)在誘導(dǎo)階段即可引起局部引流的淋巴結(jié)T細(xì)胞的活化和增殖，T細(xì)胞的增殖反應(yīng)與致敏原的致敏能力呈比例，因此可以通過比較受試物與溶劑對(duì)照引起淋巴細(xì)胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系(即刺激指數(shù)，stimulation index，SI)評(píng)估受試物的致敏能力。通過公式計(jì)算SI，若SI≥3，同時(shí)存在劑量反應(yīng)關(guān)系者判斷為致敏物[16]。

LLNA是根據(jù)淋巴結(jié)T細(xì)胞的增殖程度對(duì)受試物致敏性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，具有快速、經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)指標(biāo)客觀等特點(diǎn)，且該法所用的動(dòng)物數(shù)量較少，試驗(yàn)周期較短，不使用弗氏完全佐劑，減少了動(dòng)物在試驗(yàn)過程的不舒適感和緊張感，符合動(dòng)物福利的原則[11，17]。但有研究發(fā)現(xiàn)LLNA法會(huì)高估了化學(xué)物的致敏性，某些無致敏性的化學(xué)物質(zhì)，如表面活性劑、硅聚合物以及多元醇等化學(xué)物在傳統(tǒng)的豚鼠試驗(yàn)中顯示無致敏性，而在LLNA試驗(yàn)中出現(xiàn)了陽性結(jié)果[18-19]，因此使用該方法容易出現(xiàn)假陽性的試驗(yàn)結(jié)果。

3體外替代試驗(yàn)

2012年，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)將皮膚致敏和誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)命名為預(yù)后不良的途徑(adverse outcome pathway，AOP)[20]，皮膚致敏AOP機(jī)制如圖1所示[21]，根據(jù)皮膚過敏反應(yīng)的分子機(jī)制和化學(xué)物的特性，研究者們利用AOP中的關(guān)鍵事件建立的體外替代試驗(yàn)方法如過氧化物酶肽反應(yīng)試驗(yàn)(peroxidase peptide reactivity assay，PPRA)、直接肽反應(yīng)試驗(yàn)(direct peptide reactivity assay，DPRA)、Lusens試驗(yàn)和KeratinosensTM試驗(yàn)、骨髓皮膚致敏試驗(yàn)(Myeloid U937 skin sensitisation test，MUSST)和改良的骨髓皮膚致敏試驗(yàn)(Modified myeloid U937 skin sensitisation test，mMUSST)等均可用于評(píng)價(jià)化學(xué)物的潛在致敏性[22-25]。

圖1　皮膚致敏AOP機(jī)制Fig.1 The AOP mechanism of skin sensitization

致敏化學(xué)物與活細(xì)胞皮膚蛋白和肽共價(jià)結(jié)合形成具有免疫原性的半抗原蛋白結(jié)合物(關(guān)鍵事件1)。肽缺失將引起特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，檢測(cè)肽和蛋白復(fù)合物可以為體外皮膚致敏性試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)。過氧化物酶肽反應(yīng)試驗(yàn)(PPRA)和直接肽反應(yīng)試驗(yàn)(DPRA)都是基于關(guān)鍵事件1建立的檢測(cè)方法，但PPRA法能更好地識(shí)別前半抗原[26-27]。DPRA試驗(yàn)對(duì)苯胺、十一碳烯酸、α-己基肉桂醛檢測(cè)的結(jié)果為假陰性，并將非致敏物富馬酸、葡萄糖、十二烷基硫酸鈉、香草醛誤檢測(cè)為致敏物[28-29]。與LLNA試驗(yàn)結(jié)果相比，DPRA試驗(yàn)結(jié)果的一致性為87.5%，而PPRA試驗(yàn)結(jié)果的一致性可達(dá)到90%。

KeratinosensTM試驗(yàn)與Lusens試驗(yàn)的檢測(cè)原理和方法相似，主要是基于關(guān)鍵事件2建立的檢測(cè)方法。Lusens試驗(yàn)是在ARE啟動(dòng)子(來自NADPH：大鼠基因苯醌氧化還原酶1)的控制下向細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞插入熒光素酶基因，而KeratinosensTM試驗(yàn)是在ARE啟動(dòng)子(來自人類基因的AKR1 C2)的控制下向細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞插入熒光素酶基因，但這兩種方法都是通過測(cè)定熒光素酶的活性和細(xì)胞毒性判斷該受試物是否能激活角質(zhì)形成細(xì)胞，從而分析該受試物的致敏性[30-32]。值得注意的是，Lusens試驗(yàn)對(duì)乙二胺、苯甲酸苯酯、鄰苯二甲酸酐檢測(cè)的結(jié)果為假陰性，并將非致敏物4-甲氧基苯乙酮、6-甲基香豆素、水楊酸甲酯、丙基-4-羥苯酸鹽、香草醛誤檢測(cè)為致敏物。KeratinosensTM試驗(yàn)對(duì)甲基丙烯酸甲酯、氯化鎳、苯甲酸苯酯、鄰苯二甲酸酐檢測(cè)的結(jié)果為假陰性，并將非致敏物4-甲氧基苯乙酮、6-甲基香豆素、n-己烷、丙基-4-羥苯酸鹽、酒石酸、香草醛誤檢測(cè)為致敏物[28-29]。

骨髓皮膚致敏試驗(yàn)(Myeloid U937 skin sensitisation test，MUSST)和改良的骨髓皮膚致敏試驗(yàn)(Modified myeloid U937 skin sensitisation test，mMUSST)均使用的是一種來自骨髓或臍帶血中人類組織細(xì)胞性白血病細(xì)胞系(U937細(xì)胞系)[33-35]，該系列試驗(yàn)是基于關(guān)鍵事件3建立的檢測(cè)方法，用于測(cè)量物質(zhì)活化樹突細(xì)胞的能力，試驗(yàn)中用流式細(xì)胞儀來測(cè)量細(xì)胞表面標(biāo)志CD86表達(dá)的改變[28]。MUSST試驗(yàn)的特異性為89.7%，其靈敏度和一致性可分別達(dá)到86.2%和87.5%，但沒有標(biāo)準(zhǔn)的操作程序；而mMUSST試驗(yàn)的特異性較高，可高達(dá)97.2%，有標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，但該法的靈敏度和一致性較低，分別為62.8%和73.7%，其對(duì)肉桂醇、2-苯基丙醛、異丁子香酚、甲基二溴戊二腈、惡唑酮、鄰苯二甲酸酐、α-己基肉桂醛檢測(cè)的結(jié)果為假陰性，并將非致敏物氯化鎳誤檢測(cè)為致敏物[28-29]。

利用庫伯統(tǒng)計(jì)學(xué)算法[36]，以人體數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較分析，得到LLNA法、DPRA法、Lusens法，KeratinosensTM法、mMUSST法以及兩種方法相結(jié)合后的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度，具體見表1。由數(shù)據(jù)可知，單個(gè)體外替代試驗(yàn)方法的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度都不同程度的低于LLNA法，兩兩結(jié)合的試驗(yàn)方法中，只有DPRA和mMUSST結(jié)合后的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度與LLNA法相當(dāng)[21，28]。因此，利用上述體外替代試驗(yàn)數(shù)據(jù)來進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)致敏性評(píng)估的能力比較有限。為了提高體外替代試驗(yàn)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度，Bauch等[28]建立了一個(gè)新的預(yù)測(cè)模型，該預(yù)測(cè)模型主要是利用AOP機(jī)制中半抗原蛋白反應(yīng)(關(guān)鍵事件1)、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(關(guān)鍵事件2)、樹突細(xì)胞(關(guān)鍵事件3)綜合對(duì)化學(xué)物致敏性進(jìn)行預(yù)測(cè)。DPRA法主要是評(píng)估肽反應(yīng)，Lusens法和KeratinosensTM法主要是評(píng)估表皮角質(zhì)形成細(xì)胞反應(yīng)，mMUSST法主要是評(píng)估樹突細(xì)胞反應(yīng)。利用mMUSST法對(duì)受試物進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)結(jié)果為陽性則認(rèn)為該受試物為致敏物。利用DPRA法和Lusens法(或KeratinosensTM法)對(duì)受試物進(jìn)行檢測(cè)，若兩種檢測(cè)結(jié)果都是陰性結(jié)果則認(rèn)為該受試物為非致敏物。若mMUSST法檢測(cè)的結(jié)果與DPRA法和Lusens法(或KeratinosensTM法)檢測(cè)的結(jié)果不一致，則需進(jìn)行“證據(jù)加權(quán)”，即DPRA法、Lusens法(或KeratinosensTM)和mMUSST法3種試驗(yàn)方法同時(shí)檢測(cè)，若有兩種方法的檢測(cè)結(jié)果為陽性結(jié)果則認(rèn)為該受試物為致敏物，若有兩種方法為陰性則認(rèn)為該受試物為非致敏物。采用DPRA法、Lusens法(或KeratinosensTM)、mMUSST法3種方法對(duì)受試物的致敏性進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別可高達(dá)93%、95%、94%。

表1　幾種試驗(yàn)方法檢測(cè)性能的比較

Maxwell等[37-38]應(yīng)用皮膚致敏AOP機(jī)制建立了兩種定量評(píng)估化學(xué)物皮膚致敏能力的數(shù)學(xué)模型，分別是總半抗原蛋白模型(total haptenated protein model，tHP model)和CD8+T模型(CD8+T cell response model，CD8+T model)。利用tHP模型預(yù)測(cè)受試物可能引起表皮和真皮產(chǎn)生的半抗原蛋白的總量，采用CD8+T模型預(yù)測(cè)受試物致敏作用對(duì)皮膚的影響程度，從而可直接量化皮膚上致敏化學(xué)物暴露的劑量與特異性半抗原T細(xì)胞反應(yīng)程度之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系。綜上分析，各類動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)均有優(yōu)缺點(diǎn)，具體見表2。

表2　動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)的比較

4小結(jié)

目前化學(xué)物皮膚致敏試驗(yàn)多數(shù)還是采用傳統(tǒng)的整體動(dòng)物試驗(yàn)、體內(nèi)外替代試驗(yàn)等方法進(jìn)行檢測(cè)，隨著大量新型化學(xué)物的合成和應(yīng)用，體外替代試驗(yàn)檢測(cè)化學(xué)物致敏性的方法也逐漸增加，由于其具有快速、經(jīng)濟(jì)、高效等特點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛，但目前仍存在較多的不足。雖然利用皮膚致敏AOP機(jī)制建立的試驗(yàn)方法多達(dá)16種，但多數(shù)檢測(cè)方法尚不成熟，并且體外試驗(yàn)結(jié)果外推到體內(nèi)試驗(yàn)及人群存在一定的安全系數(shù)，應(yīng)用AOP機(jī)制建立的兩種定量評(píng)估化學(xué)物皮膚致敏能力的數(shù)學(xué)模型還需通過人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床收集的數(shù)據(jù)進(jìn)一步完善。由于體外替代試驗(yàn)具有快速、經(jīng)濟(jì)、高效、應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)，因此，多種體外替代試驗(yàn)的聯(lián)合應(yīng)用將是未來檢測(cè)化學(xué)物是否具有致敏性的主要發(fā)展趨勢(shì)，后期可基于現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和人群資料，建立多元化的體內(nèi)外試驗(yàn)技術(shù)集成平臺(tái)，根據(jù)目標(biāo)檢測(cè)物的性質(zhì)和各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合試驗(yàn)條件、方法的靈敏度、特異度、與參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的一致性、方法是否有標(biāo)準(zhǔn)的操作程序以及所檢測(cè)的物質(zhì)是否在該試驗(yàn)方法的檢測(cè)范圍內(nèi)等參數(shù)選擇合適的檢測(cè)方法，分析目標(biāo)檢測(cè)物的致敏程度。

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(2015-09-01收稿)

中圖分類號(hào)：R758.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.023

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81502792)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014CFB811)

喻才正，男，1992年生，本科生，E-mail：yucaizhenghust@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：skyting1219@126.com