AKT基因介導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立*

喻兆陽(yáng)，　何　陽(yáng)，　羅　偉，　李　蕾

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢　430030

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AKT基因介導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立*

喻兆陽(yáng)，何陽(yáng)，羅偉，李蕾△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢430030

摘要：目的通過(guò)尾靜脈高壓注射含有AKT/SB基因質(zhì)粒的方法，構(gòu)建一種新型的小鼠非酒精性脂肪肝模型。方法將40只雌性FVB/N小鼠隨機(jī)分為正常組(n=15)，模型組(n=15)，對(duì)照組(n=5)，治療組(n=5)。正常組與模型組分別給予尾靜脈高壓注射生理鹽水和AKT/SB質(zhì)粒，于第1、2、3周分批處死，每批處理5只。對(duì)照組與治療組給予尾靜脈高壓注射AKT/SB質(zhì)粒，第3周治療組開(kāi)始予以白藜蘆醇灌胃(0.04 g/kg)，對(duì)照組予以等量0.5%CMC-Na溶液灌胃，第5周處死全部對(duì)照組和治療組小鼠。檢測(cè)小鼠體重，肝濕重，肝指數(shù)，血清ALT、AST、TG、TC水平及肝組織中脂肪合成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，肝臟組織切片進(jìn)行病理學(xué)觀察，用以評(píng)價(jià)不同組別小鼠的病理生理變化。結(jié)果模型組小鼠2周后就出現(xiàn)肝功能損傷，脂質(zhì)代謝紊亂，肝臟脂肪變性明顯增加，并出現(xiàn)纖維化和明顯的炎性浸潤(rùn)，且造模時(shí)間越長(zhǎng)，病變程度越嚴(yán)重。治療組小鼠和對(duì)照組小鼠相比，血清中ALT、AST、TC水平均有不同程度的下降，肝組織中脂肪合成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平有所下降，且肝臟切片染色觀察脂肪形成明顯減少。結(jié)論通過(guò)尾靜脈高壓注射方法在肝臟表達(dá)AKT基因，F(xiàn)VB/N小鼠在3周內(nèi)可形成病變程度逐步加重的非酒精性脂肪肝模型。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝；尾靜脈高壓注射法；FVB/N小鼠；AKT基因

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史(酒精攝入量<20 g/d)或其他已知的肝臟病史，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)累積為特征的病理綜合征[1]，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)病理過(guò)程[2]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，以脂肪為代表的高熱量食物在日常膳食中所占比例明顯增加，這使NAFLD的發(fā)病率大幅提高，并已成為醫(yī)學(xué)科研的熱點(diǎn)，而動(dòng)物模型則可以用于非酒精性脂肪肝病的研究[3-4]。目前關(guān)于NAFLD動(dòng)物模型的建立常用的誘導(dǎo)方法有高脂飼料、四氯化碳(CCl4)、四環(huán)素以及乙硫氨酸等，這些方法均具有造模周期長(zhǎng)、易形成肝纖維化、實(shí)驗(yàn)成本高等缺點(diǎn)。研究表明，采用物理或機(jī)械的方法將質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入靶器官可以使目的基因在原位高效表達(dá)[5]，且周期短、成本低。而FVB/N小鼠本身作為一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，具有很多優(yōu)勢(shì)，已被大量應(yīng)用于基因工程實(shí)驗(yàn)中[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用尾靜脈高壓注射法遞送脂肪合成相關(guān)的AKT/SB基因質(zhì)粒，使之在肝細(xì)胞高效表達(dá)，以誘導(dǎo)建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，并利用白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對(duì)脂肪肝的防治作用[7]來(lái)對(duì)該模型進(jìn)行治療，從而驗(yàn)證造模成功，為進(jìn)一步的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系FVB/N小鼠，SPF級(jí)，6周齡，雌性，體重(22±3)g，共40只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]。小鼠飼養(yǎng)于室溫(23±3)℃，相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境中。

1.1.2試劑與藥物DH-5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)；康為世紀(jì)金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FASN、HA、pAKT和β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司)，白藜蘆醇(Res，純度98%，南京澤朗生物有限公司)。

1.1.3主要儀器電子天平(上?；ǔ彪娖饔邢薰?；核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)ACTGene公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Western blot及轉(zhuǎn)膜設(shè)備(BioRad公司)；顯影機(jī)(日本柯達(dá)公司)；高速離心機(jī)(Eppendorf公司5415D)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1目的基因質(zhì)粒構(gòu)建用于小鼠注射的myr-AKT(用HA進(jìn)行了標(biāo)記)和pCMV/sleeping beauty transposase(SB)質(zhì)粒按照文獻(xiàn)[7-8]描述的方法構(gòu)建，所有質(zhì)粒均導(dǎo)入DH-5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，使用康為世紀(jì)金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒抽提純化。

1.2.2小鼠尾靜脈高壓注射方法尾靜脈高壓注射按照文獻(xiàn)[9-10]描述的方法進(jìn)行，將75 μg myr-AKT質(zhì)粒和3 μg SB質(zhì)粒置于2 mL生理鹽水(0.9% NaCl)配置成溶液，將含有質(zhì)粒的生理鹽水溶液用0.22 μm濾器過(guò)濾，在5～7 s內(nèi)通過(guò)小鼠尾靜脈注射至體內(nèi)。

1.2.3動(dòng)物分組將40只6周齡健康雌性FVB/N小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組(n=15)，模型組(n=15)，對(duì)照組(n=5)，治療組(n=5)。正常組與模型組分別給予尾靜脈高壓注射生理鹽水和AKT/SB質(zhì)粒1次，于第1、2、3周分批處死，每批處死5只。對(duì)照組與治療組給予尾靜脈高壓注射AKT/SB質(zhì)粒1次，第3周治療組開(kāi)始予以白藜蘆醇灌胃(0.04 g/kg)，對(duì)照組予以等量0.5% CMC-Na溶液灌胃，第5周處死全部對(duì)照組和治療組小鼠，檢測(cè)小鼠體重，肝濕重，肝指數(shù)，血清ALT、AST、TG、TC水平，肝組織TG、TC水平及肝組織中脂肪合成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，肝臟組織切片進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1病理學(xué)檢查肝組織用4%多聚甲醛固定，由谷歌生物科技有限公司進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色與油紅O染色。在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，所有切片通過(guò)盲法閱片作出診斷，對(duì)肝脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度分級(jí)、評(píng)分。肝脂肪變性根據(jù)脂滴細(xì)胞所占面積和總細(xì)胞所占面積的比值分為0、<1/3、1/3～2/3和>2/3，共4個(gè)等級(jí)，達(dá)到2級(jí)或以上即診斷為脂肪肝。炎癥活動(dòng)度分為匯管區(qū)炎癥(P)、小葉內(nèi)炎癥(L)、碎屑樣壞死(PN)和橋接壞死(BN)4項(xiàng)分別評(píng)價(jià)，每項(xiàng)根據(jù)病變程度分別計(jì)1、2、3、4分，因?yàn)樗樾紭訅乃篮蜆蚪訅乃绹?yán)重度與預(yù)后直接相關(guān)，計(jì)分公式為P+L+2PN+2BN。

1.3.2血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定ALT用賴(lài)氏法，TC用CHO酶法，TG用TG酶法，均采用試劑盒測(cè)定，由南京建成生物工程研究所提供，按照相關(guān)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.3Western blot檢測(cè)方法肝組織勻漿后在冰上用裂解緩沖液處理30 min，以12 000 r/min離心后收集上清液。細(xì)胞裂解物在10%丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉1 h，然后分別孵育FASN、HA、AKT、p-AKT抗體4℃過(guò)夜。然后將膜在PBST(PBST中含有0.1%吐溫20)洗滌3次，然后孵育二抗1 h。然后將膜洗滌4次，并通過(guò)ECL發(fā)光底物曝光顯影，以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1小鼠體重與肝指數(shù)變化

實(shí)驗(yàn)期間正常組小鼠活動(dòng)度好，飲食正常，皮毛整潔；模型組小鼠嗜睡，毛色偏黃，3周后各組動(dòng)物均有不同程度的精神萎靡，活動(dòng)減少，皮毛凌亂的情況，各組間無(wú)顯著性差異。模型組小鼠體重和肝指數(shù)與正常組小鼠相比均呈上升趨勢(shì)，提示可能有脂肪肝的形成。白藜蘆醇治療組小鼠體重與對(duì)照組小鼠相比明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這更進(jìn)一步表明脂肪肝形成的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠全部存活。見(jiàn)圖1。

圖1　各組小鼠體重變化Fig.1 Changes of mouse body weight in each group

2.2小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)及病理變化

2.2.1肉眼觀察正常組小鼠肝臟形態(tài)正常。模型組小鼠自第1周起肝臟外形稍飽滿圓鈍，出現(xiàn)白色的局灶性脂肪沉積；隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟體積增大，切面油膩，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，可見(jiàn)肝臟明顯增大，肝組織質(zhì)地略軟，顏色變黃，表面呈花斑狀，所有小鼠肝臟均有黃白色的局灶性脂肪沉積(圖2)。

2.2.2光鏡觀察正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉肝細(xì)胞分界清晰，胞核圓，位于細(xì)胞中央。1周模型組：肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整清晰，肝索放射狀排列明顯，部分肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的脂肪空泡，少部分細(xì)胞有明顯的脂肪沉積；2周模型組：肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索放射狀排列不明顯，大部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，大部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪沉積；3周模型組：肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，呈中至重度脂肪變，炎癥程度明顯加重，部分小鼠肝臟出現(xiàn)多個(gè)炎癥壞死灶，連接成片，但未見(jiàn)明顯的肝纖維化發(fā)生(圖2)。

與正常組比較，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠肝細(xì)胞脂肪變性及組織炎癥進(jìn)一步加重；而治療組與相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組相比，肝組織脂肪變性程度及組織炎癥范圍明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

肝臟形態(tài)與肝組織HE染色(×400)；A：正常組；B：1周模型組；C：2周模型組；D：3周模型組圖2　小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)及病理變化Fig.2 Histomorphological and pathological changes of the liver in mice

組別例數(shù)肝脂肪變性程度(例)0級(jí)1級(jí)2級(jí)3級(jí)肝組織炎癥程度(分)正常組5500001周模型組502301.34±0.38**2周模型組501312.13±0.26**3周模型組500235.02±1.45**對(duì)照組500234.86±0.96治療組513101.42±0.73##

與正常組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，##P<0.01

2.3脂肪肝模型小鼠肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)含量的變化見(jiàn)表2。血清TC在造模1～3周期間，與相對(duì)應(yīng)的正常組相比，明顯有隨時(shí)間的推移而逐漸升高的趨勢(shì)，提示模型組小鼠肝臟出現(xiàn)硬化，膽固醇的酯化發(fā)生障礙。

各組小鼠肝功能指標(biāo)ALT及肝指數(shù)的變化見(jiàn)表2。在肝細(xì)胞內(nèi)，ALT主要分布于細(xì)胞胞質(zhì)中，而AST 80%分布于線粒體內(nèi)，少數(shù)分布于細(xì)胞胞質(zhì)中。當(dāng)肝細(xì)胞輕度損傷時(shí)即輕度變性、細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，從細(xì)胞內(nèi)逸出的主要是胞漿酶ALT，當(dāng)肝細(xì)胞重度損傷時(shí)，線粒體內(nèi)AST便釋放至血清中。在本實(shí)驗(yàn)中，與正常組比較，各模型組ALT和肝指數(shù)升高，各個(gè)值隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)而增高，部分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明模型組小鼠造模2周后就出現(xiàn)肝功能損傷，且造模時(shí)間越長(zhǎng)，損傷程度越嚴(yán)重。但小鼠肝功能指標(biāo)AST與正常組基本持平，說(shuō)明小鼠肝臟有一定肝功能損傷，但是損傷程度較輕，沒(méi)有十分嚴(yán)重的肝臟病變。

與對(duì)照組相比較，灌胃給藥白藜蘆醇的治療組小鼠肝臟較為鮮紅，表面脂肪形成大大減少，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性；HE染色和油紅O染色也顯示出治療組小鼠肝臟中脂肪變性的肝細(xì)胞較對(duì)照組顯著減少，見(jiàn)圖3。治療組ALT和肝指數(shù)也較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)(表2)。這些均表明白藜蘆醇驗(yàn)證小鼠非酒精性脂肪肝模型構(gòu)建成功。

表2　各組血清ALT、AST、TC、TG水平及肝指數(shù)比較

與正常組比較，*P<0.05**P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.05

A：肝臟形態(tài)；B：肝組織HE染色(×400，箭頭指示為脂肪空泡)；C：肝臟油紅O染色(×400，紅色小點(diǎn)代表聚集的脂滴)；1：正常組；2：對(duì)照組(高表達(dá)AKT基因)；3：治療組(使用白藜蘆醇處理)圖3　各組小鼠肝臟形態(tài)、肝組織HE染色和油紅O染色圖Fig.3 Gross examination of the live，and HE staining and Oil red O staining of live tissues in each group

2.4Western blot檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)Western blot方法檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型組與正常組相比，AKT和p-AKT蛋白得到過(guò)量表達(dá)(圖4)，提示遞送的AKT基因在模型小鼠體內(nèi)成功過(guò)量表達(dá)。

對(duì)于小鼠肝細(xì)胞脂肪合成酶基因(FASN基因)的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)模型組與正常組相比，基因FASN表達(dá)上調(diào)，即AKT基因誘導(dǎo)FASN基因表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)在肝臟累積。而白藜蘆醇治療組與模型組相比，AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(圖4)，而只有FASN基因表達(dá)明顯降低，即可得出白藜蘆醇并不通過(guò)阻斷AKT/mTOR通路，而是通過(guò)直接下調(diào)FASN基因表達(dá)水平抑制脂肪的從頭合成，從而抑制肝臟脂肪合成代謝，繼而起到治療脂肪肝的作用。

3討論

NAFLD是發(fā)展中國(guó)家最常見(jiàn)的肝臟疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示這種代謝綜合征的特點(diǎn)是肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常，伴有肥胖和胰島素抵抗。NAFLD的很多風(fēng)險(xiǎn)因素是明確的，但潛在的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚。目前還沒(méi)有有效的治療方法可以根治NAFLD[11]。因此建立一個(gè)穩(wěn)定可靠、病理演變過(guò)程相符的NAFLD動(dòng)物模型，對(duì)研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制及治療方法具有重要意義[12]。

目前國(guó)內(nèi)外已建立多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NAFLD模型，如通過(guò)高脂和(或)高膽固醇飼料喂養(yǎng)造成的營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型，禁食后攝入髙糖、高淀粉誘發(fā)脂肪肝、藥物中毒性脂肪肝模型，全胃腸外營(yíng)養(yǎng)造成的脂肪肝模型等，但這些模型均有其局限性，如營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需8～12周；禁食后攝入髙糖、高淀粉誘發(fā)脂肪肝不符合臨床上脂肪肝的發(fā)病過(guò)程；藥物中毒性脂肪肝模型動(dòng)物死亡率高；全胃腸外營(yíng)養(yǎng)造成的脂肪肝模型，雖然該模型與人類(lèi)疾病相似，但由于操作復(fù)雜無(wú)法廣泛推廣應(yīng)用[13-15]。

與常規(guī)建模方法相比，尾靜脈高壓注射法建立小鼠NAFLD模型僅需3周，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。它不同于普通的尾靜脈注射，而是將大體積的裸質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，引起小鼠一過(guò)性心衰，使注入液體由下腔靜脈經(jīng)肝靜脈迅速返流入肝臟，使導(dǎo)入的DNA未能與血清中的核酸酶有效接觸就可進(jìn)入肝細(xì)胞，從而大大減少了核酸酶對(duì)DNA的降解作用[16]。且大量的質(zhì)粒溶液可導(dǎo)致小鼠循環(huán)血量的急劇增加，超過(guò)其心臟負(fù)荷，使血液積聚在肝血竇中不能回流，延長(zhǎng)了質(zhì)粒DNA在肝竇中的停留時(shí)間，從而被肝組織細(xì)胞攝取[17]。Tada等[18]曾通過(guò)靜脈導(dǎo)管將質(zhì)粒DNA高壓注射到大鼠的中央靜脈，使肝組織有高水平的目的基因表達(dá)。這些研究表明了通過(guò)尾靜脈高壓注射質(zhì)粒溶液可使目的基因在肝臟高效表達(dá)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明：PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)途徑是脂肪合成的重要調(diào)節(jié)途徑，是多種細(xì)胞活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子，包括細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖和存活。本實(shí)驗(yàn)使用的AKT基因和SB基因是通過(guò)PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控脂質(zhì)代謝的。PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)途徑能夠調(diào)節(jié)脂肪合成相關(guān)因子SREBP-1及其相關(guān)生酯酶的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。SREBP1通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活葡萄糖到脂肪酸代謝的關(guān)鍵限速酶脂肪合成酶(FASN)使之表現(xiàn)出過(guò)表達(dá)從而來(lái)調(diào)控脂質(zhì)合成。即AKT的激活可以引起從頭脂肪酸合成的增加和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的顯著增加[19-21]。所以在本實(shí)驗(yàn)中，我們采取尾靜脈高壓注射的方法使AKT基因在肝臟高效表達(dá)，通過(guò)上述信號(hào)途徑引起小鼠肝臟細(xì)胞大量合成脂肪酸，使之在細(xì)胞中累積從而導(dǎo)致脂肪肝的形成。本法建模的機(jī)制是：通過(guò)尾靜脈高壓注射AKT基因，使其在肝臟高效表達(dá)，AKT基因通過(guò)PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)途徑調(diào)節(jié)脂肪合成相關(guān)因子SREBP-1，使之通過(guò)調(diào)控FASN基因過(guò)表達(dá)使肝細(xì)胞從頭脂肪酸合成增加，脂質(zhì)含量顯著增加。致使小鼠肝功能損傷、脂質(zhì)代謝紊亂，從而逐漸形成病變程度逐步加重的NAFLD。

本建模方法以肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察，HE染色、油紅O染色等病理觀察、血清生化指標(biāo)、肝組織TG和TC含量檢測(cè)作為小鼠建模是否成功的觀測(cè)指標(biāo)。模型組血清ALT和TC含量高于正常組。實(shí)驗(yàn)中病理組織檢驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)判定符合疾病標(biāo)準(zhǔn)[22]。實(shí)驗(yàn)中血清的AST變化無(wú)顯著差異，推斷為AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，只有當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，才能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度偏高。據(jù)此可推斷我們構(gòu)建的脂肪肝模型只是造成了肝組織的脂肪浸潤(rùn)，而沒(méi)有嚴(yán)重破壞肝臟。而白藜蘆醇具有增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化能力、減少肝細(xì)胞脂質(zhì)積聚、改善肝功能的作用，可作為NAFLD氧化損傷的調(diào)節(jié)劑，起到治療作用[23]。本實(shí)驗(yàn)中治療組小鼠肝臟組織的形態(tài)學(xué)、病理學(xué)及血清中生化指標(biāo)的改善也可作為建模成功的佐證。

通過(guò)尾靜脈高壓注射AKT質(zhì)粒的方法建立NAFLD小鼠模型用時(shí)短、死亡率低、成本低、與人類(lèi)疾病特征相似，基本符合人類(lèi)疾病自然發(fā)病規(guī)律，避免了其他改良方法的缺點(diǎn)，是一種可供今后科研和臨床研究使用的較有價(jià)值的動(dòng)物模型。

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(2015-07-20收稿)

Establishment of AKT Gene-mediated Non-alcoholic Fatty Liver Models in Mice

Yu Zhaoyang，He Yang，Luo Weietal

SchoolofPharmacy，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo establish a novel non-alcoholic fatty liver animal model by hydrodynamic injections of plasmids containing AKT/SB gene via the tail vein.MethodsForty FVB/N female mice were randomly divided into normal group(n= 15)，model group(n=15)，control group(n=5)and treatment group(n=5).Animals in normal group and model group were treated by hydrodynamic injections of normal saline and naked AKT/SB plasmids，respectively，via the tail vein.Every five mice in the two groups were killed at the 1st，2nd，3rd week，respectively.Mice in treatment group and control group were treated by hydrodynamic injections of naked AKT/SB plasmids through the tail vein and then treated with resveratrol(i.g 0.04 g/kg)and equal 0.5% CMC-Na solution，respectively，at the 3rd week.They were sacrificed in both control and treatment groups at the 5th week.The body weight，liver weight，serum ALT，AST，TC and TG levels and expression levels of protein related to lipid synthesis were measured.Liver tissues were obtained and histopathologically examined to evaluate the physiologic and pathological changes in different groups.ResultsAt 2 weeks，the liver function injury was found in mice in model group，the disorder of lipid metabolism occurred，and the hepatic steatosis was significantly increased.Besides，there were obvious inflammatory infiltration and fibrosis in model group.The lesions became severe with the time of modeling.The serum levels of ALT，AST and TG and adipogenesis-related protein levels were significantly decreased and the adipogenesis was markedly reduced in liver tissues in treatment group when compared with those in model group.ConclusionNon-alcoholic fatty liver disease models in FVB/N mice were successfully established by hydrodynamic injections of AKT/SB gene via the tail vein，and the lesions tended to gradually worsen within 3 weeks.

Key wordsnon-alcoholic fatty liver；hydrodynamic tail vein injections；FVB/N mice；AKT gene

中圖分類(lèi)號(hào)：R575.5

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.011

*華中科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(No.81172653)

喻兆陽(yáng)，男，1993年生，本科生，E-mail:yzyhans@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail:leileilesure@163.com