P2X2受體在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用*

劉　艷，　宋鵬輝，　唐迎春，　張宇星，　詹　莉，　胡亞丹，　朱明秋，　鄧學(xué)軍△

1武漢市第八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢　4300102華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢　430022

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P2X2受體在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用*

劉艷1，宋鵬輝2，唐迎春1，張宇星1，詹莉1，胡亞丹1，朱明秋1，鄧學(xué)軍2△

1武漢市第八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢4300102華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430022

摘要：目的通過(guò)研究P2X2受體(嘌呤受體)蛋白在顳葉癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)水平及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖水平，以及應(yīng)用P2X2受體拮抗劑亮藍(lán)G(Brilliant Blue G，BBG)后對(duì)顳葉癲癇的影響，探討P2X2受體在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。方法應(yīng)用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立SD大鼠顳葉癲癇模型，將大鼠分為正常鹽水對(duì)照組、急性發(fā)作組、慢性自發(fā)性發(fā)作組；其中慢性自發(fā)性發(fā)作組又分為空白對(duì)照組(生理鹽水)和亮藍(lán)G干預(yù)組，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)P2X2受體及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)水平，GFAP反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P2X2受體主要表達(dá)于大鼠海馬組織的CA1、CA3、齒狀回、門(mén)區(qū)，并且在丘腦也有一定的表達(dá)；P2X2受體及GFAP在慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組中的表達(dá)明顯高于正常鹽水對(duì)照組和急性發(fā)作組(P<0.05)；而亮藍(lán)G干預(yù)組與慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組相比，P2X2受體及GFAP表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)2X2受體可能在顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制中有重要作用，阻滯P2X2受體可能是治療顳葉癲癇的潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：顳葉癲癇；P2X受體；亮藍(lán)G；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；匹羅卡品

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的發(fā)作性疾病，中國(guó)有癲癇患者約900萬(wàn)，其中難治性癲癇占25%左右，全國(guó)的難治性癲癇患者至少有200萬(wàn)人以上。1972年，“嘌呤受體”的概念由Burn-stock首次提出，用于描述細(xì)胞膜腺苷受體和三磷酸腺苷(ATP)受體。根據(jù)國(guó)際藥理協(xié)會(huì)(IuPHAR)1998年對(duì)受體和藥物的分類(lèi)命名目錄，對(duì)胞外腺苷敏感的受體稱(chēng)為P1，對(duì)胞外核苷酸敏感的受體稱(chēng)為P2，前者屬G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors，GPcRs)家族，包括A1、A2a、A2b、A3四類(lèi)；后者包括P2X和P2Y兩類(lèi)，其中P2Y屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，而P2X則屬于配體ATP門(mén)控的離子通道(ligand-gated ion channels，LGIcs)，當(dāng)胞外ATP結(jié)合P2X受體時(shí)，P2X通道打開(kāi)，允許陽(yáng)離子通過(guò)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，有5個(gè)P2Y(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11)和7個(gè)P2X2受體已被克隆并闡明其藥理學(xué)特性[1]。

既往研究通過(guò)原位雜交和免疫組化技術(shù)證實(shí)P2X2受體在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有廣泛而大量的分布。P2X2受體具有多種生理功能，包括調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，刺激細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)和釋放，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷甚至凋亡等[2-3]。大量研究證實(shí)神經(jīng)遞質(zhì)異常與炎性免疫反應(yīng)均參與顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制，因此我們推測(cè)P2X2受體可能是顳葉癲癇發(fā)病的上游機(jī)制。本研究通過(guò)檢測(cè)各組大鼠顳葉癲癇模型海馬腦組織中的P2X2受體表達(dá)水平及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖水平，以探討P2X2受體在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠90只，體重范圍為200～250 g，所有大鼠來(lái)源于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。飼養(yǎng)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：溫度維持在24℃～25℃，濕度維持在50%～60%，12 h晝夜交替，并保證充足的飲用水以及飼料供應(yīng)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

抗P2X2受體抗體(購(gòu)自Abcam公司)；抗GFAP受體抗體(購(gòu)自Abcam公司)；亮藍(lán)G(Brilliant Blue G，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)；氯化鋰(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)；鹽酸匹羅卡品(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)；硫酸阿托品針劑(購(gòu)自中國(guó)上海禾豐制藥有限公司)；安定針劑(購(gòu)自中國(guó)天津制藥有限責(zé)任公司)；10%水合氯醛(購(gòu)自中國(guó)武漢協(xié)和醫(yī)院藥劑科)。生理鹽水(購(gòu)自中國(guó)青島華仁藥業(yè)有限公司)溶解氯化鋰粉劑以及鹽酸匹羅卡品粉劑，水溶物于室溫隔光保存。

1.3大鼠顳葉癲癇動(dòng)物模型制備

給予大鼠腹腔注射氯化鋰預(yù)處理(127 mg/kg)，17.5 h后，腹腔注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，0.5 h后，腹腔注射匹羅卡品(15 mg/kg)。癲癇的發(fā)作嚴(yán)重程度參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分為5個(gè)等級(jí)：①面部及口部運(yùn)動(dòng)；②具有節(jié)奏的規(guī)律性點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；③前肢的陣攣運(yùn)動(dòng)；④前肢的陣攣運(yùn)動(dòng)以及后肢陣攣及站立；⑤大鼠旋轉(zhuǎn)、全身陣攣及左右搖晃跌倒。模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠發(fā)作等級(jí)必須達(dá)到≥4級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。若大鼠癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度<4級(jí)，則按30 min的時(shí)間間隔以及15 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)再次注射匹羅卡品水溶液。若經(jīng)4次注射匹羅卡品后(總劑量為60 mg/kg)，大鼠仍未達(dá)到≥4級(jí)的發(fā)作，則不再注射。成功誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠，在其癲癇持續(xù)狀態(tài)到達(dá)1 h后，則腹腔注射安定(10 mg/kg)終止癲癇持續(xù)狀態(tài)。誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠在24 h后進(jìn)入潛伏期。

1.4動(dòng)物分組

90只SD雄性大鼠，其中6只腹腔注射生理鹽水而非匹羅卡品，作為正常鹽水對(duì)照組，剩余84只大鼠分批建立顳葉癲癇模型，根據(jù)模型制作后癲癇發(fā)作的情況分為急性發(fā)作組和慢性自發(fā)性發(fā)作組，慢性自發(fā)性發(fā)作組又分為空白對(duì)照組(生理鹽水)和亮藍(lán)G干預(yù)組。

1.5腦電圖監(jiān)測(cè)

大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛后，經(jīng)束縛固定于操作臺(tái)上，2枚針灸針作為電極，插入與顳葉相對(duì)的頭皮處(位于內(nèi)耳門(mén)前方0.65 cm，中線旁0.4 cm)，參考電極置于兩眼外眥連線之間的皮下。腦電圖信號(hào)經(jīng)0.53 Hz及30 Hz的頻率濾波后，輸入腦電信號(hào)采集系統(tǒng)。所有大鼠均行腦電圖監(jiān)測(cè)以記錄腦電波形(每周1次，每次2～4 h)。

1.6行為學(xué)觀察

成功誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠，15 d后行24 h視頻腦電圖監(jiān)測(cè)，以確認(rèn)其是否有慢性自發(fā)性發(fā)作的行為學(xué)表現(xiàn)。行為學(xué)觀察參數(shù)為：自急性發(fā)作至出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作的潛伏期、癲癇發(fā)作頻率、慢性自發(fā)性發(fā)作潛伏期內(nèi)大鼠的死亡比例等。

1.7免疫組化檢測(cè)

免疫組化染色采用SABC法。梯度乙醇脫蠟后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。隨后用0.3%H2O2水溶液作用15 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，采用山羊血清封閉20 min(室溫)，加入一抗(1：500)，4℃溫盒內(nèi)過(guò)夜，其后步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片在同一放大倍數(shù)(×400)、同一光強(qiáng)度下拍攝，經(jīng)灰度調(diào)節(jié)后用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量切片上陽(yáng)性反應(yīng)物的平均吸光度值，用平均吸光度值表示陽(yáng)性顆粒表達(dá)強(qiáng)度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1腦電圖

該實(shí)驗(yàn)采用定量腦電圖的方法統(tǒng)計(jì)各組大鼠的棘波發(fā)放數(shù)目。鹽水對(duì)照組的腦電圖波形主要以α波(8～10 Hz，20～120 μV)為主，并伴有低幅度的β波及少量的δ波。在出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作的28只大鼠中，有24只大鼠的腦電圖出現(xiàn)較為規(guī)律的棘波發(fā)放，其頻率多集中于28 Hz，波幅不高于200 μV。急性發(fā)作組及亮藍(lán)G干預(yù)組的腦電圖特點(diǎn)為在各個(gè)簇狀棘波發(fā)放的波形后存在平直線性波形。而鹽水對(duì)照組幾乎未捕捉到棘波發(fā)放；在慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠的腦電圖中(圖1)，少見(jiàn)簇狀棘波發(fā)放以后的平直線性波形。

圖中箭頭指棘波圖1　慢性自發(fā)性發(fā)作組典型腦電圖記錄Fig.1 Typical electroencephalogram of chronic spontaneous epileptic seizure

2.2行為學(xué)觀察結(jié)果

腹腔注射匹羅卡品后，大鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)異常，包括口部運(yùn)動(dòng)、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、濕狗樣抖動(dòng)。模型建立過(guò)程中，4只(4/84)在注射藥品時(shí)死亡；63只(63/84)成功誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)，誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)的63只大鼠中，13只(13/63)由于未能有效終止癲癇持續(xù)狀態(tài)而死亡；84只中，有17只(17/84)未能誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)。成功誘發(fā)癲癇急性發(fā)作的50只大鼠中，采用隨機(jī)方法選取6只(6/50)予以急性期處死，作為急性發(fā)作組；剩余的44只大鼠進(jìn)入潛伏期，有7只(7/44)在潛伏期內(nèi)死亡。經(jīng)過(guò)(33.0±6.5)d[3]的潛伏期后，有9只(9/37)沒(méi)有出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作；剩余的28只(28/37)大鼠在視頻檢測(cè)中出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作，將這28只大鼠歸為慢性自發(fā)性發(fā)作組，并將這28只大鼠中18只(18/28)設(shè)為亮藍(lán)G干預(yù)組、10只(10/28)為空白對(duì)照組。其中亮藍(lán)G干預(yù)組分為50 mg組6只(6/18)、100 mg組6只(6/18)、200 mg組6只(6/18)，同樣空白對(duì)照組也分為50 mg組3只(3/10)、100 mg組3只(3/10)、200 mg組4只(3/10)。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究發(fā)現(xiàn)大部分成功誘發(fā)癲癇急性發(fā)作的大鼠在(33.0±6.5)d時(shí)出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作，本實(shí)驗(yàn)也觀察到類(lèi)似的結(jié)果，與以往實(shí)驗(yàn)相似[3]。

2.3大鼠免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2.3.1P2X2受體在各組大鼠海馬組織中的表達(dá)水平P2X2受體在各組大鼠腦組織中均有一定的表達(dá)，并主要分布于CA1、CA3、齒狀回及門(mén)區(qū)，在丘腦也有少量的表達(dá)(圖2)。

2.3.2膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在各組大鼠海馬組織中的表達(dá)水平GFAP的表達(dá)水平反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇急性發(fā)作組及慢性自發(fā)性發(fā)作組中均有較多增殖，在亮藍(lán)G干預(yù)組增殖減低(圖3)。

3討論

既往研究表明，在全身多種組織、系統(tǒng)中，都可以檢測(cè)到P2受體的存在。P2X受體的研究伊始，僅僅局限于藥理學(xué)方面，直到20世紀(jì)中期，隨著研究的深入，7種P2X受體亞基被克隆，關(guān)于它的研究便越來(lái)越多。P2X受體廣泛分布于全身的各組織，不同的亞基類(lèi)型分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，以及以平滑肌細(xì)胞為主的多個(gè)組織部位[4-5]。通過(guò)Northern blot和原位雜交技術(shù)等研究顯示P2X各受體亞型mRNA多表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)、結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)中[6-7]。其中P2X2在大腦皮層、海馬、韁核、黑質(zhì)致密部、下丘腦腹正中核和弓形核視上核以及室旁核、三叉神經(jīng)中腦核、腹外側(cè)核、迷走神經(jīng)背核和孤束核等部位均有大量表達(dá)[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，P2X2受體在各組大鼠的海馬組織中均有一定程度的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)顯示，成功誘發(fā)癲癇發(fā)作的大鼠，P2X2受體主要表達(dá)于CA1、CA3及門(mén)區(qū)，在丘腦也有一定程度的表達(dá)。P2X2受體在慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組的表達(dá)水平明顯高于其他各組。與之對(duì)應(yīng)的腦電圖監(jiān)測(cè)記錄發(fā)現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作組中棘波發(fā)放數(shù)目明顯多于其他各組。亮藍(lán)G(Brilliant Blue G)是一種新型的生物染色劑，可以阻斷P2X2受體，且無(wú)明顯生物毒性，近來(lái)被廣泛應(yīng)用于P2X2受體相關(guān)研究中[9]。在亮藍(lán)G干預(yù)組中腦電圖記錄棘波發(fā)放數(shù)目減少，視頻監(jiān)測(cè)其癲癇發(fā)作次數(shù)減少，而免疫組化檢測(cè)顯示P2X2受體及GFAP的表達(dá)水平較相應(yīng)劑量鹽水空白對(duì)照組為低，且與亮藍(lán)G劑量呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)提示P2X2受體的表達(dá)水平與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖程度有著相類(lèi)似的趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，在癲癇的慢性自發(fā)性發(fā)作期，給予大鼠亮藍(lán)G處理可減少大鼠自發(fā)性癲癇發(fā)作，可減少大鼠腦組織P2X2受體及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。因此，可推論P(yáng)2X2受體通路在癲癇急性發(fā)作后有輕度的表達(dá)上調(diào)，而癲癇反復(fù)發(fā)作的原因也極有可能與在癲癇急性發(fā)作后導(dǎo)致P2X2受體的表達(dá)失控相關(guān)[10-11]。

a：正常鹽水對(duì)照組；b：急性發(fā)作組；c：50 mg鹽水空白對(duì)照組；d：亮藍(lán)G 50 mg干預(yù)組；e：100 mg鹽水空白對(duì)照組；f：亮藍(lán)G 100 mg干預(yù)組；g：200 mg鹽水空白對(duì)照組；h：亮藍(lán)G 200 mg干預(yù)組；c～h屬于慢性自發(fā)性發(fā)作組，圖中箭頭指示染色后的P2X2受體。A：癲癇慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組P2X2受體表達(dá)水平明顯高于正常鹽水對(duì)照組和急性發(fā)作組(*P<0.05)；B：亮藍(lán)G干預(yù)組P2X2受體水平與慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組相比明顯降低(*P<0.05 **P<0.01)圖2　免疫組化檢測(cè)各組大鼠海馬CA3區(qū)P2X2受體表達(dá)水平(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of P2X2 receptor in the CA3 region of rat hippocampus(×400)

a：正常鹽水對(duì)照組；b：急性發(fā)作組；c：50 mg鹽水空白對(duì)照組；d：亮藍(lán)G 50 mg干預(yù)組；e：100 mg鹽水空白對(duì)照組；f：亮藍(lán)G 100 mg干預(yù)組；g：200 mg鹽水空白對(duì)照組；h：亮藍(lán)G 200 mg干預(yù)組；c～h屬于慢性自發(fā)性發(fā)作組，圖中箭頭所示為染色的星形膠質(zhì)細(xì)胞。A：癲癇慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組GFAP表達(dá)水平明顯高于正常鹽水對(duì)照組和急性發(fā)作組(*P<0.05)；B：亮藍(lán)G干預(yù)組GFAP表達(dá)水平與慢性自發(fā)性發(fā)作空白對(duì)照組相比明顯降低(*P<0.05 **P<0.01)圖3　免疫組化檢測(cè)各組大鼠海馬CA3區(qū)GFAP表達(dá)水平(×400)Fig.3 Immunohistochemical staining of GFAP in the CA3 region of rat hippocampus(×400)

綜上所述，本研究結(jié)果提示，P2X2受體通路可能參與了顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制，且亮藍(lán)G可能對(duì)P2X2受體通路有輕度的阻滯作用。免疫組化分析作為一種半定量分析，具有一定的局限性，且亮藍(lán)G并非P2X2受體特異性拮抗劑，而P2X2受體通路如何誘導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖而參與了顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制尚有待更深入的研究。

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(2015-11-22收稿)

Role of P2X2 Receptor in the Pathogenesis of Temporal Lobe Epilepsy

Liu Yan1，Song Penghui2，Tang Yingchun1etal

1DepartmentofNeurology，TheEighthHospitalofWuhan，Wuhan430010，China2DepartmentofNeurology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo explore the role of P2X2 receptor in the development of temporal lobe epilepsy by examining the expression levels of P2X2 in brain tissues of rats with temporal lobe epilepsy，the astrogliosis and the effect of brilliant blue G(BBG)，a P2X2 receptor antagonist，on temporal lobe epilepsy.MethodsThe models of temporal lobe epilepsy were established by intraperitoneal injection of LiCl-pilocarpine into SD rats.The animals were divided into normal saline control group，acute epileptic seizure group and chronic spontaneous seizure group(including blank control subgroup and BBG subgroup).The expression levels of P2X2 receptor and glial fibrillary acidic protein(GFAP)were detected in hippocampal tissues by immunohistochemistry.ResultsThe P2X2 receptor was found to mainly express at CA1，CA3，dentate gyrus and hilus in the hippocampus，as well as in the hypothalamus.The expression levels of P2X2 receptor and GFAP were significantly increased in the blank control subgroup as compared with those in normal saline control group and acute epileptic seizure group(P<0.05).They were profoundly decreased in BBG subgroup when compared with those in blank control subgroup(P<0.05).ConclusionThe P2X2 receptor may play an important role in the development of temporal lobe epilepsy，and it may become a potential therapeutic target for temporal lobe epilepsy.

Key wordstemporal lobe epilepsy；P2X2 receptor；brilliant blue G；glial fibrillary acidic protein；pilocarpine

中圖分類(lèi)號(hào)：R742.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.007

*武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No.WX14A09)

劉艷，女，1971年生，主任醫(yī)師，E-mail：miss8670@126.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：dengxuejun1965@126.com