FAT/CD36對棕櫚酸抑制神經(jīng)細(xì)胞促食欲肽表達(dá)的影響*

馬　炎，　王蕭怡，　張　旭，　楊年紅

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，教育部環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品營養(yǎng)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢　430030

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論著

FAT/CD36對棕櫚酸抑制神經(jīng)細(xì)胞促食欲肽表達(dá)的影響*

馬炎，王蕭怡，張旭，楊年紅△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，教育部環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品營養(yǎng)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430030

摘要：目的分析棕櫚酸處理對小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N1E-115)食欲相關(guān)肽神經(jīng)肽Y(NPY)、刺鼠基因相關(guān)蛋白(AgRP)基因表達(dá)的影響，探討脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT/CD36)在此過程中的作用。方法取對數(shù)生長期的細(xì)胞用10 μmol/L棕櫚酸培養(yǎng)5、10、15、20 min，牛血清白蛋白(BSA)為對照組，提取mRNA，檢測細(xì)胞NPY和AgRP mRNA的表達(dá)。采用10 μmol/L棕櫚酸培養(yǎng)20 min，比較加或不加FAT/CD36抑制劑N-油?；虼牾啺?SSO)預(yù)處理對細(xì)胞NPY、AgRP、FAT/CD36 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果①10 μmol/L棕櫚酸處理細(xì)胞，NPY、AgRP mRNA的表達(dá)隨時間逐漸降低，20 min降至最低；②10 μmol/L棕櫚酸處理20 min，加入SSO預(yù)處理30 min組與未加入SSO組相比，NPY、AgRP mRNA表達(dá)降低的幅度明顯減小。結(jié)論培養(yǎng)的N1E-115神經(jīng)細(xì)胞中加入棕櫚酸處理可抑制NPY、AgRP mRNA的表達(dá)，而這種抑制作用是通過FAT/CD36途徑實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：棕櫚酸；FAT/CD36；NPY；AgRP

肥胖的根本原因是能量攝入大于能量消耗，下丘腦是機(jī)體能量平衡的調(diào)節(jié)中樞，對各種營養(yǎng)素、激素信號的正確感知和精確調(diào)控是維持能量平衡的關(guān)鍵[1]。下丘腦弓狀核神經(jīng)元可以感知機(jī)體的能量供應(yīng)及消耗狀態(tài)，接受和整合營養(yǎng)素、激素及神經(jīng)內(nèi)分泌等信號，通過增加或減少相應(yīng)中樞食欲調(diào)節(jié)肽的釋放而產(chǎn)生飽足感和饑餓感，對攝食行為進(jìn)行調(diào)節(jié)[2]，NPY和AgRP是重要的促進(jìn)食欲的中樞神經(jīng)肽。利用藥物或基因敲除手段抑制下丘腦肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)活性使長鏈脂酰輔酶A(long-chain fatty acyl-CoA，LCFA-CoA)濃度顯著上升，可導(dǎo)致NPY和AgRP表達(dá)明顯下降，動物攝食量大幅度減少[3]。FAT/CD36是介導(dǎo)長鏈脂肪酸(long chain fatty acid，LCFA)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要膜蛋白，其表達(dá)水平及轉(zhuǎn)運(yùn)LCFA進(jìn)入細(xì)胞的能力可影響細(xì)胞內(nèi)LCFA-CoA的濃度。使用FAT/CD36特異性抑制劑SSO可使心肌細(xì)胞攝取脂肪酸的速率下降80%[4]，而FAT/CD36過表達(dá)可使肌細(xì)胞攝取脂肪酸的速率大幅提高[5]。另外動物實(shí)驗(yàn)表明，肥胖易感幼鼠用腺病毒介導(dǎo)短發(fā)夾RNA(shRNA)沉默下丘腦腹內(nèi)側(cè)FAT/CD36基因后，體重和身體脂肪比對照組顯著增加[6]。本研究旨在通過細(xì)胞培養(yǎng)探討FAT/CD36是否參與脂肪酸對中樞神經(jīng)細(xì)胞食欲相關(guān)肽表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料

N1E-115神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(上海拜力生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；0.25%胰酶+0.02% EDTA溶液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；BSA(低游離脂肪酸，脂肪酸含量<0.005%，美國MP公司)；棕櫚酸(palmitic acid，PA，純度≥99%，美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8，日本同仁化學(xué)研究所)；焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Sigma公司)；Trizol(Invitrogen公司)；第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa生物科技有限公司)；引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。Eppendorf低溫高速離心機(jī)、NANODROP 1000微量紫外分光光度計(jì)，ABI HT7900 real-time RT-PCR儀。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

N1E-115細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，1～2 d換液1次。

1.3BSA培養(yǎng)液和脂性培養(yǎng)液的配制

①取1.5 g BSA加入5 mL雙蒸水，配制成30% BSA溶液。②稱取1.182 g棕櫚酸放入250 mL用雙蒸水配制的0.01 mol/L NaOH溶液中，70℃水浴下30 min促進(jìn)充分溶解，配制成20 mmol/L的棕櫚酸儲存液。③分別取330 mL 30% BSA和10、25、50 μL棕櫚酸儲存液，在20 mL DMEM培養(yǎng)液中混勻中和，用無菌濾器過濾除菌，制成含有10、25、50 μmol/L棕櫚酸的脂性培養(yǎng)液。對照組應(yīng)用的BSA培養(yǎng)液中不加入棕櫚酸，所有干預(yù)組的BSA含量均為0.5%，pH值在7.1～7.2之間。

1.4CCK-8實(shí)驗(yàn)

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，邊緣孔用無菌PBS填充。37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，棄去含血清的培養(yǎng)液，分別加入不含血清的BSA培養(yǎng)液和含棕櫚酸的培養(yǎng)液，每孔100 μL，設(shè)5個復(fù)孔。37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)。棕櫚酸對N1E-115細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)(圖1結(jié)果未全部顯示)：選取棕櫚酸濃度分別為10、25、50 μmol/L，處理時間分別為10、20、30 min，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。取上清，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值。同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)液、CCK-8)，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=[A(棕櫚酸處理)-A(空白)]/[A(調(diào)零)-A(空白)]×100%，A(棕櫚酸處理)：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和棕櫚酸孔的吸光度值；A(空白)：具有培養(yǎng)液和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度值；A(調(diào)零)：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有棕櫚酸的孔的吸光度值。

1.5棕櫚酸干預(yù)

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞80%～85%融合后，饑餓12 h，分別給予不含血清的BSA培養(yǎng)液和含10 μmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)液干預(yù)5、10、15、20 min。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3～4次。

1.6FAT/CD36抑制劑SSO處理

將細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞80%～85%融合后，饑餓12 h，分別加入含有或者不含有5 μmol/L SSO的DMSO溶液，37℃培育30 min。PBS沖洗3次，分別給予不含血清的BSA培養(yǎng)液和含10 μmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)液干預(yù)20 min。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3～4次。所有的干預(yù)組DMSO的含量均小于0.05%。

1.7細(xì)胞mRNA水平測定

細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞成熟后進(jìn)行RNA提取及熒光實(shí)時定量PCR：按Trizol說明書提取細(xì)胞中總RNA，核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR。目的基因的cDNA序列在GenBank中查出，用Primers5.0軟件設(shè)計(jì)引物，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。SYBR Green PCR擴(kuò)增程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)后加載溶解曲線。以GAPDH作為參照基因，采用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各基因的相對表達(dá)。

表1　GAPDH、FAT/CD36、NPY及AgRP基因的引物序列

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1N1E-115細(xì)胞生長形態(tài)的觀察及棕櫚酸對N1E-115細(xì)胞增殖的影響

通過倒置顯微鏡觀察(圖1A)N1E-115細(xì)胞在培養(yǎng)及傳代過程中的生長情況。鏡下，N1E-115細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)過程中細(xì)胞分布均勻，生長狀態(tài)良好，排列緊密。N1E-115細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小基本一致。經(jīng)不同濃度棕櫚酸處理后，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞集落明顯，形態(tài)無明顯變化，且無明顯的細(xì)胞碎片。如圖1B所示，10 μmol/L棕櫚酸分別處理N1E-115細(xì)胞10、20 min，與BSA對照組比較，細(xì)胞活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此上述棕櫚酸處理濃度和時間，不會因細(xì)胞活性的降低對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

A：培養(yǎng)24 h N1E-115細(xì)胞(×40)；B：細(xì)胞存活率圖1　N1E-115細(xì)胞形態(tài)及10 μmol/L棕櫚酸干預(yù)后N1E-115細(xì)胞的存活率Fig.1 The cell morphology of N1E-115 and the cell viability of N1E-115 treated with 10 μmol/L PA

2.2棕櫚酸對NPY、AgRP mRNA表達(dá)的時間效應(yīng)

如圖2所示，細(xì)胞饑餓12 h(T=0)時，NPY和AgRP基因表達(dá)水平最高，加入BSA和含10 μmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)液均使細(xì)胞NPY和AgRP基因表達(dá)水平下降，20 min時降至最低。相同時間點(diǎn)的比較發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸組NPY和AgRP mRNA表達(dá)在20 min時顯著低于BSA組(P<0.05)。

與T=0組比較，*P< 0.05；與相同時間點(diǎn)BSA組比較，#P<0.05圖2　10 μmol/L棕櫚酸干預(yù)N1E-115細(xì)胞不同時間NPY、AgRP mRNA的表達(dá)Fig.2 Expression of NPY and AgRP mRNA in N1E-115 cells treated with 10 μmol/L PA for different time

2.3棕櫚酸對FAT/CD36 mRNA表達(dá)的時間效應(yīng)

FAT/CD36 mRNA的表達(dá)在T=0處最低，隨著棕櫚酸處理時間的延長，20 min時表達(dá)量最高(P<0.05)(圖3)。

與T=0組比較，*P<0.05；與相同時間點(diǎn)BSA組比較，#P<0.05圖3　10 μmol/L棕櫚酸干預(yù)N1E-115細(xì)胞不同時間FAT/CD36 mRNA的表達(dá)Fig.3 Expression of FAT/CD36 mRNA in N1E-115 cells treated with 10 μmol/L PA for different time

2.4SSO預(yù)處理對FAT/CD36、NPY、AgRP mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與未加入SSO的棕櫚酸組相比，SSO預(yù)處理后FAT/CD36 mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；NPY和AgRP mRNA表達(dá)降低的幅度明顯減弱(P<0.05)。

3討論

下丘腦可接收外周激素和營養(yǎng)素傳入信號，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部位的傳入信號進(jìn)行整合，通過傳出信號調(diào)節(jié)攝食行為和能量消耗，促使機(jī)體達(dá)到能量平衡[7-9]。近年來，越來越多的研究表明神經(jīng)細(xì)胞能夠感應(yīng)脂肪酸，而下丘腦神經(jīng)細(xì)胞對脂肪酸的感應(yīng)在食欲調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[10-11]。脂肪酸感應(yīng)失調(diào)可以引起能量失衡，最終導(dǎo)致肥胖的發(fā)生[12]。下丘腦神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控食欲是一個十分復(fù)雜的過程，雖然有研究表明向下丘腦灌注脂肪酸能夠降低食欲及減少肝臟葡萄糖的輸出[11]，但是在過度喂養(yǎng)的大鼠中下丘腦中樞脂肪酸感知失調(diào)，不能正確調(diào)節(jié)攝食[8]。因此對于下丘腦神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控食欲的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

與T=0組比較，*P< 0.05；與20 min 10 μmol/L棕櫚酸組比較，#P<0.05圖4　SSO預(yù)處理后10 μmol/L棕櫚酸干預(yù)N1E-115細(xì)胞20 min FAT/CD36、NPY、AgRP mRNA表達(dá)的變化Fig.4 Expression of FAT/CD36，NPY and AgRP mRNA in N1E-115 cells treated with SSO and then with 10 μmol/L PA for 20 min

本實(shí)驗(yàn)選取N1E-115細(xì)胞作為研究對象，該細(xì)胞是一種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，可用于研究神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的改變。棕櫚酸是人類飲食中最常見的飽和脂肪酸，占人血漿中飽和脂肪酸的65%，總脂肪酸的32%[13]。代謝綜合征的患者與正常人相比血清棕櫚酸水平明顯增加[14]。本研究選取棕櫚酸處理神經(jīng)細(xì)胞，通過細(xì)胞形態(tài)觀察和CCK-8實(shí)驗(yàn)確定棕櫚酸濃度和干預(yù)時間，以保證棕櫚酸處理不會因細(xì)胞活性的改變對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L棕櫚酸干預(yù)細(xì)胞20 min時，NPY和AgRP顯著降低，表明棕櫚酸可以抑制該神經(jīng)細(xì)胞NPY/AgRP基因的表達(dá)。

FAT/CD36是一種廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞的單鏈跨膜糖蛋白，作為一種重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到顯著的作用[11，15]。之前對于FAT/CD36的研究大部分集中在外周組織中，如：脂肪酸能夠促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞[16]以及新生的心肌細(xì)胞[17]FAT/CD36的表達(dá)，高脂喂養(yǎng)的小鼠心肌FAT/CD36的表達(dá)較正常小鼠有5倍增長[18]，電刺激能夠上調(diào)骨骼肌FAT/CD36的表達(dá)并且增加脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)FAT/CD36在神經(jīng)細(xì)胞感知脂肪酸，調(diào)節(jié)攝食方面發(fā)揮著重要的作用。Le Foll等[9]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)油酸刺激對下丘腦神經(jīng)元的興奮和抑制作用受FAT/CD36影響最大，且不受細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝速率的影響。同時動物實(shí)驗(yàn)表明，用腺病毒介導(dǎo)shRNA沉默大鼠下丘腦腹中核FAT/CD36基因后，頸動脈注入脂肪乳，可以明顯改善單純脂肪乳灌注引起的攝食降低[12]。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，加入正常生理濃度的棕櫚酸處理神經(jīng)細(xì)胞一定時間，F(xiàn)AT/CD36的表達(dá)會逐漸增加，同時NPY/AgRP會逐漸降低。為明確FAT/CD36增高與NPY/AgRP的關(guān)系，比較加入和不加入FAT/CD36的抑制劑SSO預(yù)處理細(xì)胞30 min后，棕櫚酸處理對NPY/AgRP表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSO處理可顯著減弱棕櫚酸對NPY/AgRP表達(dá)的抑制作用。在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)SSO處理FAT/CD36的表達(dá)較對照組也有升高，由于SSO的作用是特異性與FAT/CD36結(jié)合，導(dǎo)致這種蛋白失去原有的功能，并不會降低其表達(dá)量[20]。我們推測FAT/CD36表達(dá)增加是由于FAT/CD36功能抑制后的代償性變化。提示FAT/CD36通過感知脂肪酸濃度，并將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞使N1E-115神經(jīng)細(xì)胞下調(diào)NPY、AgRP mRNA的表達(dá)。

由之前的動物實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)會造成大鼠肥胖，肥胖大鼠下丘腦FAT/CD36的表達(dá)明顯高于正常大鼠，但是其NPY/AgRP的表達(dá)并沒有降低，結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們推測肥胖大鼠FAT/CD36感受脂肪酸的功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致FAT/CD36不能正常調(diào)節(jié)NPY/AgRP的表達(dá)，最終導(dǎo)致肥胖發(fā)生。同時最近的研究還發(fā)現(xiàn)FAT/CD36介導(dǎo)的LCFA攝取需要富含Cav-1的胞膜窖參與[21]，Cav-1在輔助FAT/CD36轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸過程中起到重要作用，有研究表明抑制Cav-1的表達(dá)能夠降低FAT/CD36轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的作用。因此FAT/CD36影響NPY和AgRP表達(dá)的具體機(jī)制以及Cav-1與FAT/CD36之間的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

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(2016-02-24收稿)

FAT/CD36 Is Involved in the Suppression of the Expression of NPY and AgRP Genes by Palmitic Acid in N1E-115 Cells

Ma Yan，Wang Xiaoyi，Zhang Xuetal

DepartmentofNutritionandFoodHygiene，MOEKeyLabEnvironmentandHealth,HubeiKeyLaboratoryofFoodNutritionandSafety,SchoolofPublicHealth，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo explore the effect of palmitic acid on the gene expression of neusopeptide Y(NPY)and agouti gene-related protein(AgRP)in murine neuroblastoma cell line N1E-115，and to investigate the role of fatty acid translocase(FAT/CD36)in the process.MethodsN1E-115 cells at the logarithmic phase were treated with 10 μmol/L palmitic acid for 5，10，15 and 20 min，with bovine serum albumin(BSA)serving as control.The expression of NPY and AgRP mRNA was detected in the cells.Additionally，the effect of sulfosuccinimidyl-oleate(SSO)，an inhibitor of FAT/CD36，on the expression of NPY，AgRP and FAT/CD36 was examined in N1E-115 cells treated with 10 μmol/L palmitic acid for 20 min.Results①Palmitic acid(10 μmol/L)could significantly decrease the expression of NPY and AgRP mRNA in a time-dependent manner.②The decrease in the expression of NPY and AgRP mRNA was significantly attenuated in cells treated with 10 μmol/L palmitic acid for 20 min and SSO for 30 min.ConclusionPalmitic acid can suppress the expression of NPY and AgRP genes in N1E-115 cells via the fatty acid transport protein FAT/CD36 pathway.

Key wordspalmitic acid；FAT/CD36；NPY；AgRP

中圖分類號：R589.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.001

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81273052)

馬炎，女，1987年生，博士研究生，E-mail：584907965@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：zynh@mails.tjmu.edu.cn