不同倍性花生光合特性研究

梅　輝，韋　琴，付秀芹，江　楠

(1. 武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415；2. 武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

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不同倍性花生光合特性研究

梅輝1，韋琴2，付秀芹1，江楠1

(1. 武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415；2. 武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

摘要：用0.01%秋水仙素誘導(dǎo)使花生染色體加倍，通過(guò)單細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目和DNA含量鑒定花生倍性，比較不同倍性花生葉片的氣孔大小、氣孔密度和葉綠素含量。結(jié)果表明：秋水仙素加倍處理后的花生葉片氣孔更大，單位面積的氣孔數(shù)量減少，葉綠素含量增加。

關(guān)鍵詞：秋水仙素；花生；不同倍性；氣孔；葉綠素

多倍化是植物進(jìn)化變異的自然現(xiàn)象，也是促進(jìn)植物進(jìn)化的重要力量，多倍體化現(xiàn)象在植物界相當(dāng)普遍[1]。植物多倍體化后往往帶來(lái)外部形態(tài)、光學(xué)特性、抗逆性等一系列改變。近年來(lái)關(guān)于植物多倍體研究報(bào)導(dǎo)較多，研究結(jié)果不盡一致。徐偉鈺等[2]在研究二、四倍體蘿卜光合特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，四倍體葉綠素含量明顯高于二倍體，且氣孔增大，氣孔密度減?。焕顬閇3]在研究不同倍性甜瓜生物學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同倍性甜瓜單位葉面積的葉綠素a和葉綠素b含量隨著染色體倍性的增加而增加；但侯喜林等[4]在研究白菜不同倍性材料間光合特性差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同倍性白菜葉綠素a和葉綠素b含量差異不顯著。

多倍體植物由于細(xì)胞內(nèi)含物增加往往表現(xiàn)出形態(tài)增大、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加、抗逆性增強(qiáng)等特點(diǎn)。三倍體和四倍體西瓜的耐熱性優(yōu)于二倍體西瓜[5]；異源八倍體小黑麥具有結(jié)實(shí)率高、飽滿度好、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)[6]。花生是我國(guó)重要的油料作物之一，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位?；ㄉ耘喾N為異源四倍體(2n=4x=40)，包括兩個(gè)染色體組[7]。目前尚無(wú)對(duì)花生八倍體的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)用秋水仙素對(duì)花生進(jìn)行誘導(dǎo)加倍，采用一種全新的單細(xì)胞DNA含量鑒定法，對(duì)不同倍性的花生葉片的光合特性進(jìn)行比較，旨在為花生多倍體育種及優(yōu)良花生品種的選育奠定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及試劑

花生種子由中國(guó)農(nóng)科院油料作物研究所惠贈(zèng)；秋水仙素購(gòu)自上海悠祥生化試劑有限公司；纖維素酶、果膠酶購(gòu)自武漢華順生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1根尖染色體裝片制作及倍性鑒定用0.01%秋水仙素浸泡花生種子4h，然后換清水清洗后沙土培養(yǎng)致花生胚根長(zhǎng)到6cm。采用去壁低滲火焰干燥法[8]制作花生染色體裝片。

將制作好的染色體裝片用兩種方法進(jìn)行倍性鑒定，一是經(jīng)Giemsa染液染色后直接鏡檢，通過(guò)染色體數(shù)目確定倍性；二是定量測(cè)定裝片上單個(gè)間期細(xì)胞DNA含量。由于染色體加倍后，多倍體細(xì)胞DNA含量隨之加倍，因此可通過(guò)定量測(cè)定各單個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量來(lái)鑒定細(xì)胞的倍數(shù)。將干燥后的單細(xì)胞裝片進(jìn)行染色固定后，利用DNA含量自動(dòng)檢測(cè)儀進(jìn)行分析(武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司)，分別記錄裝片上單個(gè)細(xì)胞核DNA含量的數(shù)據(jù)，隨機(jī)選取20個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較經(jīng)秋水仙素加倍后的花生根尖細(xì)胞核DNA含量和未經(jīng)秋水仙素處理的空白對(duì)照組花生根尖細(xì)胞核DNA含量差異。

1.2.2葉表皮裝片制作取生長(zhǎng)至15cm高的植株第4片展開(kāi)葉(自基部算起)，用鋒利刀片切取靠近中部主脈兩側(cè)組織，切取葉片為1～2cm左右。用鑷子撕取葉下表皮，置于干凈的載玻片上，碘液染色后顯微鏡檢，觀察氣孔形態(tài)，統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)目，計(jì)算氣孔密度(個(gè)數(shù)/mm2)。計(jì)算方法：顯微鏡目鏡的視野直徑為18mm，根據(jù)S=πR2計(jì)算顯微鏡的視野面積為254.64 mm2，因高倍鏡放大400倍，所以實(shí)際觀測(cè)的視野為0.636 mm2，據(jù)此計(jì)算氣孔密度[9]。

取強(qiáng)光照射1.5h的花生葉片，用透明指甲油均勻涂在葉片下表面。待完全干燥后揭取下并制成氣孔裝片。用0.1mm的目鏡測(cè)微尺測(cè)量21個(gè)氣孔的大小，計(jì)算氣孔長(zhǎng)和寬的平均值[9]。計(jì)算方法：在光學(xué)顯微鏡高倍鏡下將目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校對(duì)，將鏡臺(tái)測(cè)微尺第8個(gè)刻度與目鏡測(cè)微尺第28格對(duì)齊。通過(guò)公式：

目鏡測(cè)微尺格值(μm)=鏡臺(tái)測(cè)微尺兩重合線間的格數(shù)×10/目鏡測(cè)微尺兩重合線間格數(shù)計(jì)算得到目鏡測(cè)微尺的格值為2.86μm。將高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)得的氣孔所占目鏡測(cè)微尺格數(shù)乘目鏡測(cè)微尺格值，所得即為放大400倍后氣孔開(kāi)啟時(shí)的長(zhǎng)、寬數(shù)數(shù)值，測(cè)量樣本數(shù)不低于20[9]。

1.2.3葉綠素含量測(cè)定[10]稱取潔凈并已去中脈的新鮮功能葉0.1g，加入少量石英砂和95%的乙醇3mL，研磨成勻漿，再加入95%乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置5 min后過(guò)濾并洗滌殘?jiān)翢o(wú)色，用95%乙醇定溶后測(cè)定665nm、649nm和470 nm的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度(mg/L)。計(jì)算公式：

Ca= 13.95A665- 6.88A649

Cb= 24.96A649- 7.32A665

C總= Ca+ Cb

(每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值)

圖 1　不同倍性花生根尖細(xì)胞染色體圖 (10×100)Fig.1　Chromosome number of peanut root tip cell with different ploidy (10×100)

2結(jié)果與分析

2.1根尖染色體倍性鑒定

由圖1可辨認(rèn)出不同倍性花生染色體之間的差異，經(jīng)秋水仙素加倍后的花生根尖染色體條數(shù)明顯多于未經(jīng)秋水仙素處理過(guò)的花生。粗略統(tǒng)計(jì)圖1-B的染色體條數(shù)，連結(jié)在一起成團(tuán)的及辨認(rèn)不清的不計(jì)，共得染色體53條。若加上辨認(rèn)不清的染色體，則可判斷經(jīng)過(guò)秋水仙素加倍后的花生為八倍體。

2.2DNA細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)分析儀進(jìn)行倍性鑒定

由于花生染色體數(shù)目多且染色體小，不易辨認(rèn)，所以同時(shí)采用了單細(xì)胞DNA含量鑒定法對(duì)細(xì)胞的倍性進(jìn)行鑒定。DNA細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)分析儀對(duì)各裝片的單個(gè)細(xì)胞核DNA含量進(jìn)行掃描，掃描樣本數(shù)為20個(gè)單細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，秋水仙素處理過(guò)的花生根尖細(xì)胞DNA含量明顯高于空白對(duì)照組，其含量約是空白對(duì)照組的2倍，說(shuō)明秋水仙素處理使染色體加倍，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量加倍。

2.3葉表皮(氣孔大小及密度)

2.3.1氣孔形態(tài)碘液染色后的氣孔裝片顯微鏡檢，結(jié)果見(jiàn)圖2，空白對(duì)照組氣孔保衛(wèi)細(xì)胞圓且厚，整體形態(tài)接近卵圓形，葉綠體分散排列，副保衛(wèi)細(xì)胞形狀較規(guī)則，接口處狹窄。秋水仙素處理后保衛(wèi)細(xì)胞更細(xì)長(zhǎng)，葉綠體集中排列在保衛(wèi)細(xì)胞外側(cè)，副保衛(wèi)細(xì)胞邊緣規(guī)則度不高。接口處較寬。通過(guò)氣孔形態(tài)的差異分析，加倍后的花生保衛(wèi)細(xì)胞在吸水后更易牽動(dòng)微纖絲使氣孔打開(kāi)。

2.3.2氣孔大小和密度顯微鏡檢測(cè)放大400倍后氣孔開(kāi)啟時(shí)的長(zhǎng)、寬平均數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)

表1　花生根尖細(xì)胞裝片處理組與空白組DNA含量比較

表2。由表2可見(jiàn)，經(jīng)秋水仙素加倍的花生葉片氣孔大于未加倍的花生植株葉片。這種開(kāi)度更大的氣孔，能減少蒸騰阻力，有利于花生植株體內(nèi)水分和礦物營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸。同時(shí)加強(qiáng)了光合作用中氣體交換的力度，有利于光合作用的順利進(jìn)行和加速有機(jī)物的合成。因而推測(cè)加倍后的花生在抗逆性方面更具優(yōu)越性。表2所示，秋水仙素加倍處理后，單位面積內(nèi)氣孔數(shù)目略減少，氣孔密度有所降低。這一結(jié)果和氣孔大小結(jié)果對(duì)應(yīng)，正是由于加倍后氣孔增大，而導(dǎo)致氣孔密度降低。

2.4葉綠素含量

秋水仙素處理使得花生染色體加倍后，八倍體花生葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量均高于未處理的四倍體，說(shuō)明八倍體花生植株的光合性能優(yōu)于四倍體(表2)。

圖 2　不同倍性花生葉片氣孔形態(tài)(10×100)Fig.2　Stomatal morphology of peanut leaves with different ploidy

氣孔特征Stomatalcharacteristics長(zhǎng)(μm)Length寬(μm)Width數(shù)目Numbers密度Density葉綠素含量(mg/L)ChlorophyllcontentCaCbC總空白對(duì)照組Normalgroup19.68±2.853.54±0.8613.7±2.5521.59±4.034.4141.6446.058秋水仙素處理組Colchicinetreatmentgroup23.90±2.366.18±1.2312.1±1.5019.07±2.365.6322.3828.012

3討論

多倍體育種在植物育種中廣泛應(yīng)用，秋水仙素誘導(dǎo)使染色體加倍是植物多倍體育種常用的方法。多倍體由于染色體組成倍增加，而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物增多，通常會(huì)使植株在外部形態(tài)、生理特征、營(yíng)養(yǎng)成分及生態(tài)適應(yīng)性等方面發(fā)生相應(yīng)改變，使植株體現(xiàn)多倍體優(yōu)越性，尤其在藥用植物中被廣泛應(yīng)用[11]。

多倍體育種常存在多倍體倍性鑒定的問(wèn)題，最傳統(tǒng)的鑒定方法是制作染色體裝片，通過(guò)顯微鏡檢確定染色體數(shù)目，進(jìn)而確定倍性。但對(duì)于大部分雙子葉植物，由于本身染色體小且染色體數(shù)目多，而使得染色體數(shù)目難以確定。2010年之后出現(xiàn)一種新的采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞核DNA含量來(lái)鑒定植物多倍體倍性的方法[12-14]。本研究在此基礎(chǔ)上嘗試了一種全新的方法。制備細(xì)胞裝片，采用武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司的DNA含量自動(dòng)檢測(cè)儀掃描裝片上的單細(xì)胞，通過(guò)DNA含量確定倍性。這種方法操作簡(jiǎn)單，并與染色體數(shù)目鑒定結(jié)果一致。

多倍體育種是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，其研究雖然取得一定進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題。針對(duì)不同植物，由于染色體數(shù)目和大小不一樣，而細(xì)胞核空間有限，能容納的染色體數(shù)目有一定限度，因此，要對(duì)生物體不同倍性進(jìn)行比較以確定其最佳倍性。野生花生為二倍體，目前的栽培種是四倍體，秋水仙素能成功將其加倍為八倍體，且加倍之后氣孔增大，葉綠素含量增加，光合特性體現(xiàn)出優(yōu)越性，但能否培育出結(jié)實(shí)率更高的花生八倍體還有待進(jìn)一步研究。

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Research on Photosynthetic Properties of Different Ploidy Peanut

MEI Hui1, WEI Qin2, FU Xiu-qin1, JIANG Nan1

(1.DepartmentofBioscienceandBiotechnology,WuhanInstituteofBioengineering,Wuhan430415,China; 2.EnvironmentalandBiologicalEngineeringCollege,WuhanTechnologyandBusinessUniversity,Wuhan430065,China)

Abstract:0.01% colchicine was used to induce doubling of peanut chromosomes, and peanut ploidy was identified through single cell chromosome number and DNA content. By comparison of leaf stomatal size, stomatal density, chlorophyll content of different ploidy peanut, it was find that: after colchicine doubling treatment, the size of peanut leaf stomatal became larger, with the reduced number of stomata per unit area and the increased chlorophyll content.

Key words:colchicine; peanut; different ploidy; stomata; chlorophyll

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.201; Q343.2+44

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：梅輝(1981-)，女，湖北襄陽(yáng)人，武漢生物工程學(xué)院講師，碩士，主要從事植物遺傳育種研究。E-mail:52884653@qq.com

基金項(xiàng)目：武漢市教育局科研項(xiàng)目 (2009K089)

收稿日期：2015-12-29

DOI：10.14001/j.issn.1002-4093.2016.01.006