中國花生主產(chǎn)區(qū)根際土壤真菌多樣性及區(qū)系分析

李愛軍，姚彥坡，張立田，肖　琎，周　鑫，張　鑫，項愛麗，張建民，董李學(xué)

(唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，河北 唐山 063000)

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中國花生主產(chǎn)區(qū)根際土壤真菌多樣性及區(qū)系分析

李愛軍，姚彥坡*，張立田，肖琎，周鑫，張鑫，項愛麗，張建民，董李學(xué)

(唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，河北 唐山 063000)

摘要：本實驗對采自全國花生主產(chǎn)區(qū)10個省市15個區(qū)縣的105份花生根際土壤樣品中的1255株真菌進行了區(qū)系分析，初步明確了不同產(chǎn)區(qū)花生根際土壤中常見真菌種類及真菌數(shù)量的差異。采用形態(tài)學(xué)分類的方法，歸屬21個屬，大多數(shù)為有絲分裂真菌，其中，16個屬為有絲分裂真菌，2個屬為卵菌，3個屬為子囊菌。青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、鐮孢菌屬(Fusarium)出現(xiàn)頻率較高，其數(shù)量分別占分離真菌總數(shù)量的32.9%，16.2%和8.6%。

關(guān)鍵詞：花生；土壤；真菌；多樣性；區(qū)系分析

花生是我國重要的經(jīng)濟作物和出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一，甚至在一些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有主導(dǎo)地位。近年，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和市場需求不斷擴大，我國花生種植面積逐年遞增，但隨之而來的是各種花生病害的發(fā)生有增加趨勢，特別是土壤傳播病害的種類和發(fā)生程度尤重。土壤是各種微生物重要的棲境之一，這就為包括真菌在內(nèi)的微生物的生長創(chuàng)造了適宜的生存條件和環(huán)境。花生根際土壤中既存在著多種病原真菌，同時也存在著大量的有益真菌。目前，國內(nèi)外對花生根際土壤的研究多集中在土壤污染和理化條件研究方面，對花生土壤中真菌的區(qū)系分析及種類多樣性研究鮮有報道。因此，本實驗?zāi)康氖菍ξ覈ㄉ饕N植區(qū)域的根際土壤真菌種類及多樣性進行系統(tǒng)分析，以期深入了解花生根際土壤中真菌組成、種類及多樣性，對研究和防治花生各種病害起到重要的參考作用。

1材料與方法

1.1花生根際土樣的采集

2014年3-10月，從我國11個省市15個區(qū)縣(河北：大名、豐南；河南：駐馬店；湖南：邵陽；山東：聊城，冠縣，高唐；吉林：白城；湖北：陽邏；四川：西充；天津：寶坻；遼寧：阜新；山西：定襄；重慶：奉節(jié)，石柱)不同花生種植區(qū)采集土壤樣品共105余份，取樣采取5點取樣法[1]。采集時先撥去表層土壤及覆著的枯枝落葉，在植物根際采集土壤，采集深度為3～8cm，然后將5個點的土壤樣品充分混合，迅速裝于無菌的塑料袋中，進行真菌分離和培養(yǎng)，余下部分置于低溫冰箱中保存。

1.2根際土壤真菌的分離

1.2.1供試培養(yǎng)基的選擇本次實驗選用多種培養(yǎng)基，包括孟加拉紅培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、胡蘿卜葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等，其中孟加拉紅培養(yǎng)基的分離效果最好，獲得的真菌種類較多，對真菌菌絲的生長具有抑制生長的作用，對細菌滋生也有較強的抑制作用，便于真菌純化和菌落計數(shù)。

1.2.2土壤真菌數(shù)量測定采用稀釋平板法測定[2]，土壤稀釋液涂布接種，記錄培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的菌落數(shù)，計算1g土壤中含有的真菌數(shù)量，每個土樣3次重復(fù)。

1.3土壤真菌分離與鑒定方法

稀釋平板法[2]：稱取1 g土樣置于9 mL無菌水中，充分振蕩混勻，連續(xù)稀釋1×103～1×104。取0.3 mL稀釋液置于孟加拉紅、PDA、PSA或其他培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，常溫下培養(yǎng)5～7 d，待長出菌落進行計數(shù)后分別將各真菌轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上純化，后保存菌種以待鑒定。該方法主要用于分離產(chǎn)孢能力較高的半知菌、子囊菌和卵菌，例如青霉屬、曲霉屬、擬青霉屬、粘帚霉屬、鐮孢屬、枝頂孢屬和枝孢屬等。

真菌鑒定主要采用形態(tài)學(xué)方法和顯微結(jié)構(gòu)觀察法，形態(tài)學(xué)方法主要觀測真菌菌落的顏色、形態(tài)、生長速度、色素產(chǎn)生等特征；顯微結(jié)構(gòu)觀察法主要檢測各菌落的營養(yǎng)體和繁殖體的形態(tài)特征等，將真菌鑒定到屬[3-6]。

2結(jié)果與分析

2.1花生根際土壤真菌數(shù)量分析

圖1可見，不同地區(qū)土壤真菌數(shù)量表現(xiàn)一定差異。真菌數(shù)量從高到低順序為：河北大名、河北豐南、河南駐馬店、湖南邵陽、山東冠縣、吉林白城、湖北陽邏、四川西充、天津?qū)氎妗⑦|寧阜新、山

圖1　不同地區(qū)土壤真菌數(shù)量統(tǒng)計Fig. 1　Species and amount of fungi in different areas注： A：河北大名 B：河南駐馬店 C：遼寧阜新 D：湖南邵陽 E：河北豐南 F：山西定襄 G：四川西充 H：山東冠縣 I：重慶奉節(jié) J：天津?qū)氎?K：山東高唐 L：吉林白城 M：重慶石柱 N：湖北陽邏 O：山東聊城。附表同。Note: A: Daming Hebei; B: Zhumadian Henan; C: Fuxin Liaoning; D: Shaoyang Hunan; E: Fengnan Hebei; F: Dingrang Shanxi; G: Xichong Sichuan; H: Guanxian Shandong; I: Fengjie Chongqing; J: Baodi Tianjin; K: Gaotang Shandong; L: Baicheng Jilin; M: Shizhu Chongqing; N: Yangluo Hubei; O: Liaocheng Shandong. The same below.

東聊城、山東高唐、山西定襄、重慶奉節(jié)及石柱。河北大名土壤真菌數(shù)量最高，達2.3×105cfu/g，重慶奉節(jié)土壤真菌數(shù)量最低，僅為0.8×105cfu/g。另外，不同地區(qū)花生土壤中分離到的真菌種類顯著不同，北方土壤中真菌的種類明顯多于南方，東部高于西部。

2.2花生根際土壤真菌多樣性

全國15個花生主產(chǎn)區(qū)縣105份根際土壤樣品共分離鑒定出真菌21個屬(附表)及1255株真菌。其中，有絲分裂真菌16屬，分別為青霉屬Penicillium，鐮孢霉屬Fusarium，曲霉屬Aspergillus，擬青霉屬Paecilomyces，輪枝孢屬Verticillium，木霉屬Trichoderma，枝頂孢屬Acremonium，腐質(zhì)霉屬Humicola，粘帚霉屬Gliocladium，蜜孢霉屬Sphacelia，粘束孢屬Graphium，瓶霉屬Phialophora，芽鏈束梗孢屬Pycnostysanus，褐孢霉屬Fulvia，節(jié)卵孢屬Oospora，金孢霉屬Chrysosporium等。其他屬包括：膠盤孢屬Hainesia，毛霉屬Mucor，笄霉屬Choanephora，疫霉屬Phytophthora及腐霉屬Pythium。

附表　不同區(qū)域真菌群落組成

實驗獲得的21個屬真菌中，絕大多數(shù)屬于半知菌真菌，此外，還包括子囊菌、卵菌、接合菌，沒有分離獲得擔子菌，低等的卵菌在培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生有性階段。本試驗分離到的可以引起花生病害的真菌種類有鐮孢霉屬、枝頂孢屬、曲霉屬、青霉屬、輪枝孢屬、疫霉屬、腐霉屬等，鐮孢菌分離到170株，占總數(shù)的13.9%，曲霉屬分離到82株，占總數(shù)的6.7%，青霉分離到224株，疫霉菌分離到54株，枝頂孢分離到40株，輪枝孢分離到33株。說明不同地區(qū)花生土壤中具有成為病原菌的大量真菌存在。此外，從鑒定的結(jié)果可以看出，花生土壤中有大量可以作為生防菌的潛在真菌微生物存在?；ㄉH土壤中分離到的具有生防潛力的真菌有木霉菌、粘軸霉、擬青霉、青霉等，其中木霉菌81株占分離真菌總數(shù)6.6%，說明我國花生根際土壤中具有生防潛力的微生物廣泛存在。

2.3優(yōu)勢種群

分離結(jié)果表明(圖2)，105份花生根際土樣中分離到大量的木霉菌、粘軸霉、青霉菌，說明這些可做為潛在生防菌的真菌在我國花生主產(chǎn)區(qū)廣泛分布，此外，所有花生產(chǎn)區(qū)土樣中均大量分離到鐮孢霉屬的真菌，這與我國花生主產(chǎn)區(qū)根腐病普遍較嚴重相吻合，說明引起我國根腐病的主因可能為鐮刀菌。研究指出，我國花生根際土壤中優(yōu)勢種群為：青霉屬Penicillium、鐮孢霉屬Fusarium、曲霉屬Aspergillus和木霉屬Trichoderma，其數(shù)量分別占分離真菌總數(shù)的18.3%、13.2%、6.7%和6.6%。

圖 2　不同地區(qū)優(yōu)勢菌屬分離頻率Fig. 2　Isolated frequency of dominant fungi in different areas注： 1：青霉屬Penicillium； 2：鐮孢霉屬Fusarium； 3：曲霉屬Aspergillus； 4：木霉屬Trichoderma； 5：疫霉屬Phytophthora； 6：毛霉屬Mucor； 7：腐質(zhì)霉屬Humicola； 8：腐霉屬Pythium； 9：枝頂孢屬Acremonium； 10：膠盤孢屬Hainesia； 11：笄霉屬Choanephora； 12：粘帚霉屬Gliocladium； 13：擬青霉屬Paecilomyces； 14：褐孢霉屬Fulvia； 15：瓶霉屬Phialophora。

3結(jié)論與討論

本實驗首次對我國主要花生產(chǎn)區(qū)根際土壤真菌區(qū)系及多樣性進行研究，共分離鑒定出21個屬真菌，其中優(yōu)勢屬為青霉屬(Penicillium)、鐮孢霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma)?；ㄉH土壤分離到的真菌中有7個屬為常見花生病害致病菌，鐮孢霉屬(Fusarium)、枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、輪枝孢屬(Verticillium)、疫霉屬(Phytophthora)、腐霉屬(Pythium)等。優(yōu)勢種類因其數(shù)量較大，對真菌群落的結(jié)構(gòu)和群落環(huán)境的形成有明顯的影響作用，對花生生長發(fā)育也有一定的影響。真菌的多樣性及優(yōu)勢種群也反映了真菌的生物學(xué)特性以及真菌和寄主植物與其他生態(tài)因素的相互關(guān)系。分離鑒定出的真菌中，有相當數(shù)量的具有生防潛力的木霉屬及粘帚霉屬等存在，尤其是木霉屬的真菌在防治花生土傳病害方面有著很大的潛力。

由于我國幅員遼闊花生種植區(qū)土壤的理化性質(zhì)、環(huán)境、氣候等存在很大的差別，這種狀況必然會引起土壤真菌的種類和數(shù)量差異。另外，相當一部分真菌在人工培養(yǎng)基條件下不產(chǎn)生繁殖結(jié)構(gòu)或子實體，或繼代培養(yǎng)后喪失產(chǎn)孢能力，故有些土壤真菌還不能完全分離。因此，雖然本研究基本明確了我國花生主產(chǎn)區(qū)花生根際土壤中真菌的種類，但還不能完全顯示其土壤真菌的多樣性、種群分布及區(qū)系，有待于結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)進行更深入研究。

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Analysis of Classification of Soil Fungi in Main Peanut Production Areas in China

LI Ai-jun, YAO Yan-po*, ZHANG Li-tian, XIAO Jin, ZHOU Xin, ZHANG Xin,XIANG Ai-li, ZHANG Jian-min, DONG Li-xue

(LivestockandAquaticProductsQualityInspectionandTestCenter/DepartmentofAgr.ProductQualitySafetyRiskAssessmentExperimentStation,Tangshan063000,China)

Abstract:In the study, 1255 fungal strains were isolated from 105 peanut soils collected from 15 countries in 10 provinces of China. These fungi have been identified to 21 genera, using the method of microscopical observation according to morphology. 2 genera belong to Oomycetes, 3 genera belong to Ascomycota and 16 genera belong to mitosporic fungi. In these soils, the dominant species were Penicillium, Trichoderma and Fusarium, accounting for 28.89%,14.16%and 8.64%, respectively.

Key words:peanut; soil; fungi; diversity; identification

中圖分類號：S565.2; S154.37

文獻標識碼：A

作者簡介：李愛軍(1979-)，男，河北唐山人，唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。*通訊作者：姚彥坡(1977-)，男，博士，高級農(nóng)藝師，主要從事糧油產(chǎn)品質(zhì)量安全、產(chǎn)毒真菌防控及微生態(tài)學(xué)研究。E-mail: yao7707@126.com

基金項目：國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估重大專項(GJFP201500704)；農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點實驗室開放課題

收稿日期：2015-12-22

DOI：10.14001/j.issn.1002-4093.2016.01.004