利用RIL群體檢測與花生高油酸含量連鎖的SSR標(biāo)記

陳　靜，毛瑞喜，胡曉輝，苗華榮，崔鳳高，楊偉強(qiáng)

(1. 山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省花生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 山東省種子管理總站，山東 濟(jì)南 250100)

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利用RIL群體檢測與花生高油酸含量連鎖的SSR標(biāo)記

陳靜1，毛瑞喜2，胡曉輝1，苗華榮1，崔鳳高1，楊偉強(qiáng)1

(1. 山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省花生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 山東省種子管理總站，山東 濟(jì)南 250100)

摘要：為了獲得與花生高油酸基因相連鎖的SSR標(biāo)記，應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇。本研究選用低油酸品種花育28號和高油酸品種P76配制雜交組合，構(gòu)建重組自交系(RIL)群體，采用氣相色譜法測定親本和各株系脂肪酸含量，卡方檢驗(yàn)結(jié)果為RIL群體3個(gè)環(huán)境下低油酸株系數(shù)和高油酸株系數(shù)比值均符合3∶1的分離比例，表明P76的高油酸特性由2對隱性基因控制。利用SSR標(biāo)記和BSA法，對1151對SSR引物進(jìn)行篩選擴(kuò)增，篩選出8對差異引物；以這8對引物對RIL群體中的19份低油酸家系(油酸平均含量44.06%)和24份高油酸家系(油酸平均含量80.75%)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得了2個(gè)與花生油酸含量極顯著(0.001水平)相關(guān)的標(biāo)記AH1TC5D06和FI298287，其中，標(biāo)記AH1TC5D06在RIL群體低油酸株系中的檢測符合率為84.21%，在RIL群體高油酸株系中的檢測符合率為87.50%；標(biāo)記FI298287在RIL群體低油酸株系中的檢測符合率為84.21%，在RIL群體高油酸株系中的檢測符合率為75.00%。進(jìn)而利用AH1TC5D06和FI298287對RIL群體中所有株系進(jìn)行擴(kuò)增，檢測出AH1TC5D06和FI298287與控制高油酸特性基因的遺傳距離為7.4 cM和19.8 cM。綜合分析標(biāo)記AH1TC5D06和FI298287可用于花生油酸含量的分子標(biāo)記輔助選擇。

關(guān)鍵詞：花生；高油酸；SSR；標(biāo)記輔助選擇

花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的油料作物，我國花生單產(chǎn)、總產(chǎn)均居世界前列。花生籽仁中脂肪含量達(dá)50%左右；包含8種主要脂肪酸，其中油酸和亞油酸含量最多，兩者達(dá)到花生脂肪酸總量的80%左右。油酸、亞油酸都是有益脂肪酸，對人體脂質(zhì)代謝發(fā)揮重要作用，可降低超重人群的心血管疾病和血漿中的低密度脂蛋白膽固醇含量。油酸因分子結(jié)構(gòu)中不飽和的烯鍵數(shù)目少于亞油酸，因而對氧氣、高溫等環(huán)境因子更加穩(wěn)定，不易酸敗變質(zhì)，故高油酸油料籽仁具有耐儲性好、制品貨架壽命長、油的高溫穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。國內(nèi)外均有花生高油酸突變材料的報(bào)道[3]，對于高油酸性狀由2對主基因控制得到了廣大學(xué)者的認(rèn)可，但由于不同研究者所用材料不同、分析方法、種植環(huán)境有差異，高油酸特性的遺傳也存在修飾基因、基因與背景基因型互作的作用。

Lopez等[4]認(rèn)為花生高油酸性狀由2對主基因控制，且可能存在修飾基因作用。Isleib[5]認(rèn)為控制油酸/亞油酸比值的基因表現(xiàn)出部分顯性的特點(diǎn)；ol基因與背景基因型存在互作，可能存在上位性效應(yīng)；ol基因影響多種脂肪酸含量，呈一因多效。分子生物學(xué)研究表明，F(xiàn)AD2是造成高油酸突變的候選基因，花生中存在2個(gè)FAD2同源基因ahFAD2A和ahFAD2B，分別來自A基因組和B基因組[6-10]。在正常油酸含量品種中這2個(gè)同源基因都表達(dá)或至少有一個(gè)表達(dá)，而ahFAD2A突變和ahFAD2B突變同時(shí)存在才能導(dǎo)致高油酸基因型花生的產(chǎn)生。

提高花生品種的油酸含量是我國花生品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一，所以為進(jìn)一步提高育種效率，建立該性狀DNA標(biāo)記輔助選擇方法非常有必要。Chu等[11-12]基于FAD2A基因和FAD2B基因序列開發(fā)了CAPS標(biāo)記，Barkley等[13]利用熒光定量PCR法鑒別資源中FAD2B，但與傳統(tǒng)的PCR方法相比較，CAPS和real-time PCR標(biāo)記均需要特定的限制性內(nèi)切酶或熒光定量探針，增加了花費(fèi)，更主要的是CAPS和real-time PCR標(biāo)記需要不同的技術(shù)分析平臺。Chen等[14]針對高油酸突變體F435的突變類型設(shè)計(jì)了5對引物，通過引物組配來區(qū)分高油酸、中油酸和低油酸含量的材料，其局限性是僅能區(qū)分高油酸突變體F435的突變類型，無法區(qū)分其他類型高油酸突變材料。本研究利用花育28號和P76為親本構(gòu)建的RIL群體和SSR標(biāo)記，分析高油酸含量特性的遺傳機(jī)制，檢測與控制高油酸性狀基因連鎖的SSR標(biāo)記，用于標(biāo)記輔助選擇。

1材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)材料為以花育28號為母本、P76為父本雜交衍生的RIL群體(包含146個(gè)株系)。花育28號[15]是山東省花生研究所育成的早熟高產(chǎn)高油小花生，2008年通過山東省農(nóng)作物品種審定委員會審定，父本P76是高油酸材料。RIL群體各株系及相應(yīng)親本于2010年分別種植在山東濟(jì)寧(E1)和山東萊西(E2)兩地，2011年種植在山東萊西(E3)，各株系和親本種植10株。4月28日播種，起壟覆膜雙行種植，單粒播種，9月上旬收獲晾曬放置冰箱備用。

1.2品質(zhì)測定

采用GC法測定花生RIL群體各株系和親本的種子脂肪酸含量，3次重復(fù)，計(jì)算平均值。方法如下：將待測花生仁磨碎，稱取20 mg加入5 mL離心管中，加入1 mL的苯：石油醚(1∶1)，靜置5 min。加入1.5 mL的0.5 mol/L的甲醇鈉溶液，靜置10 min。加入2 mL的飽和NaCl溶液，靜置至上清液清澈(30 min以上)。取上清60 μL至樣品瓶中，加入600 μL石油醚稀釋后上機(jī)檢測。采用Agllent Technologies 7890A氣相色譜儀進(jìn)行測定，色譜柱初溫210℃，維持9 min，升溫速率20℃/min，程序升溫至230℃，并在此溫度下維持9 min。分流比30∶1，檢測器溫度300℃。氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹高純度氦氣流量10 mL/min。

1.3基因組DNA提取和高油酸含量池、低油酸含量池的構(gòu)建

采用CTAB 法提取花生基因組DNA[16]。根據(jù)RIL群體各株系油酸含量，選取極端高油酸株系(10個(gè)，油酸含量大于80%)和極端低油酸株系(10個(gè)，油酸含量小于45%)，提取各株系DNA等量混合建立高油酸含量池(BH)和低油酸含量池(BL)；以親本和BH、BL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選多態(tài)性引物，將多態(tài)性引物進(jìn)行小群體驗(yàn)證，篩選與油酸含量符合率高的引物，進(jìn)而應(yīng)用于RIL群體所有株系，檢測SSR標(biāo)記與FAD2基因的連鎖程度。

1.4SSR標(biāo)記

SSR引物選自He等[17]、Ferguson 等[18]、Moretzsohn等[19-20]、Wang等[21]發(fā)表的引物序列及Wang等[21]中部分未公布引物序列，由金思特科技(南京)有限公司合成。篩選到的8對差異SSR引物序列見表1。PCR 在Applied Biosystems GeneAmp PCR System9700 上進(jìn)行，采用10μL PCR反應(yīng)體系：模板1.0 μL，天根Mix 6μL，引物0.6 μL，ddH2O 1.8 μL。SSR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性PAGE凝膠上分離，硝酸銀染色后進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)或掃描記錄。

1.5數(shù)據(jù)分析

SSR標(biāo)記擴(kuò)增帶型記錄，與母本帶型相同的記為A，與父本帶型相同的記為B，缺失帶記為“—”，在Excel中進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、t檢驗(yàn)和χ2測驗(yàn)。用χ2測驗(yàn)對RIL群體高油酸低油酸分離比例進(jìn)行適合性檢驗(yàn)。根據(jù)測定結(jié)果將RIL群體各株系(3個(gè)環(huán)境平均值)劃分為低油酸(小于50%)，中油酸(50%～70%之間)和高油酸(大于70%) 3 種類型，基因型分別記為A、H、B。以RIL群體高油酸含量株系(B)和低油酸含量株系(A)為材料，用Mapmaker3.0b對這些株系的表型基因型和對應(yīng)的SSR 擴(kuò)增帶型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算標(biāo)記與FAD2基因間的遺傳距離。

表 1　SSR引物序列

2結(jié)果與分析

2.1親本和RIL群體油酸含量變異和遺傳分析

花育28號為低油酸含量品種，P76為高油酸含量品種，兩者在3個(gè)種植環(huán)境下油酸含量分別為43.05%、45.64%、41.38%和80.17%、81.37%、79.99%；在3個(gè)環(huán)境下RIL群體146個(gè)株系的油酸含量變幅略有差異，分別為40.09%～81.88%、42.56%～82.07%和40.43%～81.81%(表2)，表明環(huán)境差異對油酸含量有一定影響。由附圖可見，

表 2　親本油酸含量及RIL群體變異

附圖　RIL群體3個(gè)環(huán)境下油酸含量的頻率分布圖Fig.　Distribution of the oleic content of Huayu28/P76 RIL population in 3 environments

環(huán)境Environment低油酸株系數(shù)No.oflineswithlowoleiccontent高油酸株系數(shù)No.oflineswithhigholeiccontent卡方值(χ20.05=3.84)E198390.7031E2106380.0833E3105410.5845

3個(gè)環(huán)境下RIL群體的油酸含量呈連續(xù)分布，但不是正態(tài)分布，油酸含量為65%～75%處出現(xiàn)最低點(diǎn)，以油酸含量70%為界劃分進(jìn)行遺傳分析，3個(gè)環(huán)境下低油酸株系數(shù)和高油酸株系數(shù)比值經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3∶1的分離比例(表3)，說明控制高油酸特性的基因由雙隱性基因控制。

2.2檢測與控制花生高油酸性狀基因連鎖的SSR標(biāo)記

利用1151對SSR引物對親本、BH、BL進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選到多態(tài)性引物8對；將篩選出的8對多態(tài)性引物進(jìn)行小群體驗(yàn)證(19個(gè)低油酸株系和24個(gè)高油酸株系)，低油酸株系的油酸平均含量為44.06%，高油酸株系的油酸平均含量為80.75%。結(jié)果表明8對SSR引物對RIL群體低油酸株系的檢測符合率較高，變幅為78.95%～84.21%；對RIL群體高油酸株系的檢測符合率差異極大，變幅為50.00%～87.50%，其中AH1TC5D06和FI298287對低油酸株系和高油酸株系的檢測符合率均較高。AH1TC5D06在RIL群體低油酸株系和高油酸株系中的檢測符合率分別為84.21%和87.50%，平均符合率為86.05%；FI298287在RIL群體低油酸株系和高油酸株系中的檢測符合率分別為84.21%和75.00%，平均符合率為79.07%。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，AH1TC5D06和FI298287所揭示的母本基因型株系和父本基因型株系的油酸含量差異達(dá)0.001水平(表4)。

AH1TC5D06和FI298287在RIL群體中的擴(kuò)增結(jié)果表明，3個(gè)環(huán)境下AH1TC5D06擴(kuò)增出母本基因型(A)株系的油酸含量均值分別為54.46%、54.41%、53.39%，擴(kuò)增出父本基因型(B)株系的油酸含量均值分別為66.15%、66.97%、66.23%；FI298287擴(kuò)增出母本基因型(A)株系的油酸含量均值分別為56.33%、56.04%、54.97%，擴(kuò)增出父本基因型(B)株系的油酸含量均值分別為為63.62%、63.87%、63.31%(表5)。t檢驗(yàn)結(jié)果表明， AH1TC5D06、FI298287母本基因型(A)株系和父本基因型(B)株系的油酸含量差異達(dá)極顯著水平(0.001)。

表 4　8對多態(tài)性引物在小群體中的驗(yàn)證

注：*表示在0.05 水平差異顯著；**表示在0.01 水平差異顯著；***表示在0.001 水平差異顯著；A：母本基因型；B：父本基因型。

Note: *significant atP<0.05;** significant atP<0.01;*** significant atP<0.001.A:female genotype, B:male genotype.a: Match rate of low oleic acid content materials in segregated populations;b: Match rate of high oleic acid content materials in segregated populations;c: The average match rate of high oleic acid and low oleic acid content materials in segregated populations;d:The average oleic acid content of the material with A genotype of marker in segregated populations;e: The average oleic acid content of the material with B genotype of marker in segregated populations;f: t-test of oleic acid content with A and B genotype in the segregated populations

表 5　RIL 群體中與FAD2基因連鎖的SSR標(biāo)記基因型進(jìn)行t檢驗(yàn)

AH1TC5D06和FI298287在RIL群體上的分離均符合1∶1的孟德爾遺傳(見表6)。利用Mapmaker 3.0b以RIL群體中極端株系(油酸含量低于50%和油酸含量高于70%)的表型基因型和對應(yīng)的SSR標(biāo)記擴(kuò)增帶型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分析2個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)與FAD2基因的連鎖關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AH1TC5D06和FI298287均與FAD2基因連鎖，連鎖距離分別為7.4 cM和19.8 cM。

表 6　2個(gè)SSR 標(biāo)記與FAD2基因的連鎖分析結(jié)果

3討論

微衛(wèi)星標(biāo)記具有信息量大、共顯性、操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，在花生遺傳多樣性、抗病基因、品質(zhì)基因相關(guān)標(biāo)記等方面得到應(yīng)用[22-33]。Nagy等[22]利用Gregory×Tifguard的F4代和NemaTAM×GP-NC-WS-14的F5代，獲得了與根結(jié)線蟲顯性抗性基因Rma緊密連鎖的SSR標(biāo)記。Khedikar等[23]利用SSR標(biāo)記確定了11個(gè)與花生晚斑病抗性相關(guān)的QTL，12個(gè)與花生銹病抗性相關(guān)的QTL，其中QTLrust01可解釋表型變異的6.9%～55.2%。Qin等[24]利用2個(gè)RIL群體檢測到TSWV的抗性主效QTL，qTSWV1和qTSWV2，分別與SSR標(biāo)記IPAHM287和Seq12F7連鎖。肖洋等[25]利用RIL群體和BSA法，得到1個(gè)與花生矮化病毒病抗性連鎖的分子標(biāo)記XY38，遺傳距離為7.5 cM。王輝等[26]利用SSR標(biāo)記和BSA法，獲得2個(gè)與花生北方根結(jié)線蟲病抗性基因連鎖的SSR標(biāo)記S32-380和S89-140，遺傳距離為4.421cM和7.404cM。洪彥彬等[27]發(fā)現(xiàn)標(biāo)記pPGSseq19D9與黃曲霉抗性關(guān)聯(lián)度最高，Pearson相關(guān)系數(shù)達(dá)0.913，標(biāo)記pPGSseq19D9的擴(kuò)增帶型能直接區(qū)分抗感品種，初步推斷pPGSseq19D9可能與一個(gè)貢獻(xiàn)率較大的抗黃曲霉基因連鎖。黃莉等[28]獲得與花生含油量相關(guān)的分子標(biāo)記2A5-250/240，其中，標(biāo)記2A5-250為低油材料(含油量<55%)所擁有，相符率為95.0%，標(biāo)記2A5-240為高油材料(含油量>56%)所擁有，相符率為88.9%。洪彥彬等[29]利用SSR標(biāo)記獲得與控制花生深紫色種皮基因連鎖的SSR標(biāo)記PM93/630-600，遺傳距離為5.4 cM。

花生高油酸特性分子機(jī)制研究較為集中，不同的高油酸材料雖然在核酸序列上有一定差異，而從經(jīng)典遺傳學(xué)的角度分析均認(rèn)為高油酸特性由2對隱性基因控制，相應(yīng)的候選基因分別命名為FAD2A和FAD2B。高油酸特性標(biāo)記輔助選擇方面研究，建立了FAD2A和FAD2B的CAPS標(biāo)記、FAD2B的熒光定量PCR標(biāo)記以及針對高油酸突變體F435突變類型的PCR引物。這些研究均基于美國的高油酸突變材料，而我國高油酸突變材料標(biāo)記輔助選擇方面的研究尚少，且目前尚無利用SSR標(biāo)記進(jìn)行花生高油酸材料鑒別和標(biāo)記輔助選擇的研究。本研究以我國高油酸材料和RIL群體為材料，基于表型鑒定，獲得了與FAD2連鎖的2個(gè)SSR標(biāo)記。

本研究獲得了與FAD2連鎖的2個(gè)SSR引物AH1TC5D06和FI298287，F(xiàn)AD2與AH1TC5D06間的遺傳距離為7.4 cM，與FI298287間的遺傳距離為19.8 cM。Qin等[24]公布的圖譜中，以Tifrunner×GT-C20為親本構(gòu)建的LGT圖譜中CAPS標(biāo)記ahFAD2A與AH1TC5D06間的遺傳距離為17.9 cM；以SunOleic 97R×NC94022為親本構(gòu)建的LGS圖譜中CAPS標(biāo)記ahFAD2A與AH1TC5D06間的遺傳距離為10.8 cM，CAPS標(biāo)記ahFAD2B與seq7G2-340間的遺傳距離為17.2cM。通過比對可以看出，本研究中與AH1TC5D06連鎖的FAD2基因應(yīng)該是ahFAD2A基因，位于A基因組第9染色體[24]；而與SSR標(biāo)記FI298287連鎖的FAD2基因以及FI298287與AH1TC5D06間的關(guān)系尚需通過更多可比對的SSR標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。

致謝：山東省花生研究所王傳堂研究員、袁美博士提供部分SSR引物，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)白鑫、張?jiān)烷L江大學(xué)羅忠鵬同學(xué)參加了部分?jǐn)?shù)據(jù)調(diào)查工作，特此致謝！

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Identification of SSR Markers Linked to High Oleic Content in Peanut (ArachishypogaeaL.) by RIL Population

CHEN Jing1, MAO Rui-xi2, HU Xiao-hui1, MIAO Hua-rong1, CUI Feng-gao1, YANG Wei-qiang1

(1.ShandongPeanutResearchInstitute/KeyLab.ofPeanutBiologyandGeneticImprovement,MinistryofAgri./ShandongProvincialKeyLab.ofPeanut,Qingdao266100,China; 2.ShandongSeedManagementStation,Jinan250100,China)

Abstract:To detect SSR markers linked to genes controlling high oleic content, we established RIL population derived from a cross between Huayu28 and P76, detected the fatty acid content of parents and RIL population by gas chromatography(GC). Genetic analysis indicated that the high oleic trait of P76 is controlled by two recessive genes. Using bulked segregation analysis (BSA) and peanut SSR molecular markers, there were eight SSR primers enabling to distinguish two bulks. Subsequently, the eight SSR primers were used to amplify 19 low oleic acid (44.06%) and 24 high oleic acid content lines (80.75%). It was found that 2 SSR markers AH1TC5D06 and FI298287 were tightly associated with oleic content. AH1TC5D06 and FI298287 were used to genotype the total lines of RIL population. The genetic distance between 2 SSR markers and gene controlling oleic content were 7.4 cM and 19.8cM, respectively. Our results indicated that AH1TC5D06 and FI298287 can be used in marker-assisted selection (MAS) for high oleic acid breeding in peanut.

Key words:peanut; high oleic acid; SSR; MAS

中圖分類號：S565.2; Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：陳靜(1976-)，女，山東兗州人，山東省花生研究所副研究員，博士，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail:mianbaohua2008@126.com

基金項(xiàng)目：山東省農(nóng)業(yè)良種工程；青島民生計(jì)劃(14-2-3-34-nsh)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育項(xiàng)目(2015CGPY03)

收稿日期：2015-09-22

DOI：10.14001/j.issn.1002-4093.2016.01.001