恩替卡韋和干擾素序貫作用對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBVDNA復(fù)制的影響

楊 偉，趙 超，李 婧，丁 揚(yáng)，王 雪

解放軍第89醫(yī)院傳染科，山東 濰坊 261021

論著·肝相關(guān)疾病

恩替卡韋和干擾素序貫作用對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBVDNA復(fù)制的影響

楊 偉，趙 超，李 婧，丁 揚(yáng)，王 雪

解放軍第89醫(yī)院傳染科，山東 濰坊 261021

目的 探討恩替卡韋(Entecavir，ETV)與干擾素(IFNα-2b)序貫作用對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的影響。方法 將培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞分組，單獨(dú)組中分別加入不同濃度ETV的配制液(1.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml)或IFNα-2b配制液(5 000 IU/ml、10 000 IU/ml、15 000 IU/ml)；聯(lián)合組中聯(lián)合加入ETV和IFNα-2b配制液；序貫組中先后加入ETV和IFNα-2b序貫配制液。在不同時(shí)點(diǎn)，采用MTT法檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞增殖情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA水平，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)上清液中HBsAg與HBeAg水平。結(jié)果 隨著時(shí)間延長(zhǎng)，序貫組對(duì)HepG2.2.15的HBV DNA復(fù)制抑制作用明顯大于其他兩組(P<0.05)；對(duì)HBsAg與HBeAg的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論 ETV與IFNα-2b序貫作用于HepG2.2.15細(xì)胞，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制有明顯的抑制作用，且作用強(qiáng)于單獨(dú)或聯(lián)合使用。

恩替卡韋；干擾素α-2b；HepG2.2.15細(xì)胞；HBV DNA；序貫作用

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是我國(guó)引起肝硬化、肝功能衰竭及肝細(xì)胞癌的主要原因[1]。恩替卡韋(Entecavir，ETV)是目前臨床常用的核苷酸類似物藥物，它能阻止病毒DNA鏈的延伸，使病毒停止擴(kuò)增，但需長(zhǎng)期用藥，且遠(yuǎn)期療效有待觀察。干擾素α-2b(interferon α-2b，IFNα-2b)是一種多功能免疫調(diào)節(jié)因子，其抗HBV機(jī)制可能涉及多方面[2]。雖然上述兩種藥物的抗病毒效果已取得共識(shí)，但在采用單獨(dú)、聯(lián)合或序貫使用藥物抗病毒治療等方式上仍存在較大爭(zhēng)議，一方面認(rèn)為序貫抗病毒治療可以引起病毒的耐藥性，導(dǎo)致后序治療更加困難[3]，而另一方面認(rèn)為序貫抗病毒治療可以很好的控制乙肝患者體內(nèi)的病毒數(shù)量，改善患者的生活質(zhì)量[4]。本實(shí)驗(yàn)以體外的HepG2.2.15細(xì)胞建立HBV DNA復(fù)制模型，從體外實(shí)驗(yàn)角度探討上述各種治療方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為HBV臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 HepG2.2.15細(xì)胞株購(gòu)自上海瑞鹿生物科技有限公司。精制小牛血清及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。ETV由福建廣生堂股份有限公司生產(chǎn)，ETV液制備：ETV 2片(0.5 mg/片)，研磨成粉，加入20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，室溫?cái)嚢? h，過濾除菌，調(diào)整為1.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ亟M人IFNα-2b注射液(安福隆)3 000 000 U、由天津華利達(dá)生物有限公司生產(chǎn)，干擾素液制備：取母液30 ml，加入2 970 μl完全培養(yǎng)基，混勻，調(diào)整為5 000 IU/ml、10 000 IU/ml、15 000 IU/ml，-20 ℃保存?zhèn)溆?。陰性?duì)照液：取1%二甲亞砜(DMSO) 30 μl母液加入2 970 μl完全培養(yǎng)基，混勻。

1.2 分組及藥物處理方法 從液氮罐中取出HepG2.2.15細(xì)胞，迅速水浴后，將其加入含有細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中，混勻離心棄去上清后漿細(xì)胞懸液置于含有5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用0.25%的胰酶消化，每周傳代一次，將HepG2.2.15細(xì)胞分為：(1)單獨(dú)ETV組：96孔板，10 000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后分別加入3種濃度ETV液200 μl，在2、4、6 d收集培養(yǎng)上清液用于檢測(cè);(2)單獨(dú)IFNα-2b組：96孔板，10 000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后分別加入上述3種不同濃度IFNα-2b 200 μl，同上收集上清液;(3) 聯(lián)合作用組：96孔板，10 000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后加入ECT與IFNα-2b混合藥液，同上收集上清液;(4) 序貫作用組：取中等濃度(5 μg/ml)ETV溶液加入培養(yǎng)基中處理3 d，補(bǔ)加中等濃度(10 000 IU/ml)500 μl的IFNα-2b處理1 d，取上清液0.5 ml，再加IFNα-2b(10 000 IU/ml)500 μl，2 d后留取上清0.5 ml，-70 ℃凍存。上述各組每孔復(fù)設(shè)4個(gè)復(fù)孔;(5) 陰性對(duì)照組：取母液30 μl，加入2 970 μl完全培養(yǎng)基混勻，在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)取標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 ETV與IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖影響的檢測(cè) MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司。將各組的細(xì)胞板吸取孔內(nèi)液體留存后，每孔加入90 μl新鮮培養(yǎng)液，再加入110 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸取上清，每孔加入110 μl Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)490 nm處各孔的吸光值。陽性對(duì)照為1%的DMSO溶液，陰性對(duì)照為未加入藥液的培養(yǎng)基留置最后一孔作為空白孔。

1.4 HBV DNA的檢測(cè) 取上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液3 μl進(jìn)行HBV DNA定量測(cè)定，采用PCR-熒光探針“一管法”，BioRadcfx96型全自動(dòng)熒光擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，試劑盒購(gòu)自北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/國(guó)0443-2013，操作按說明書進(jìn)行。1.5 HBsAg與HBeAg水平的檢測(cè) 取上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液50 μl用于HBsAg與HBeAg檢測(cè)，采用 ELISA，試劑盒購(gòu)自北京生物技術(shù)研究所，操作按說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 ETV、IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響單獨(dú)作用時(shí)，不同濃度ETV對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，而不同濃度的IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞有一定抑制率，與ETV組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 ETV、IFNα-2b單獨(dú)作用對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Tab 1 The inhibition effect of HepG2.2.15 cells replication by individual treatment with ETV and IFNα-2b

2.2 各組對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，IFNα-2b組、聯(lián)合作用組、序貫作用組對(duì)HBsAg分泌抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)；單用IFNα-2b組與聯(lián)合作用組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；序貫組抑制率明顯強(qiáng)于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。另IFNα-2b組、聯(lián)合作用組、序貫作用組對(duì)HBeAg抑制作用明顯強(qiáng)于ETV組(P<0.05)；單用IFNα-2b組與聯(lián)合作用組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；序貫組對(duì)HBeAg抑制作用強(qiáng)于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表2 ELISA法檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的抑制率(%)Tab 2 The HBsAg inhibition ratio of the supermatant HepG2.2.15 cells by ELISA (%)

表3 ELISA法檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清HBeAg的抑制率(%)Tab 3 The HBeAg inhibition ratio of the supermatant HepG2.2.15 cells by ELISA (%)

2.3 各組對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制作用 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HBV DNA有明顯的抑制作用，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)；但各實(shí)驗(yàn)組之間抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表4 各組HBV DNA定量檢測(cè)情況(copies/ml)Tab 4 The quantitative detection results of HBV DNA in each group (copies/ml)

3 討論

ETV是核苷酸類似物的代表性藥物，它能阻止病毒在肝細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄過程中DNA鏈的延伸，使病毒停止擴(kuò)增。然而只有長(zhǎng)期用藥才能最大限度的維持病毒的低水平，大量臨床資料證明核苷酸類似物對(duì)于HBV ccDNA無直接清除作用[5]，且容易誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生耐藥的變異，導(dǎo)致用藥期間病毒的反跳。IFNα-2b是一種多功能免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，具有特殊的抗病毒作用[6]。HepG2.2.15細(xì)胞株是由2個(gè)頭尾相連的HBV DNA全基因重組質(zhì)粒沾染受體細(xì)胞HepG2而獲得的，可在體外增殖，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的DANE顆粒，同時(shí)還能產(chǎn)生大量的復(fù)制中間體，是目前各實(shí)驗(yàn)室廣泛用于篩選和評(píng)價(jià)體外抗HBV藥物良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2]。

本實(shí)驗(yàn)采用HepG2.2.15細(xì)胞株為模型，觀察上述不同用藥方法時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)被藥物抑制的動(dòng)力學(xué)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ETV對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的自身增殖無明顯抑制作用，而IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞自身增殖有明顯抑制作用，與臨床上觀察到單用干擾素抗病毒治療時(shí)，其療效和毒副作用均大于核苷酸類藥物的現(xiàn)象一致。雖然各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HBV DNA都有較高的抑制率，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，聯(lián)合組和序貫組對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg有明顯抑制作用，以序貫組作用最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示序貫療法可能成為一種治療乙肝的有效方式?？墒怯捎趯?shí)驗(yàn)時(shí)間過短，藥物能否導(dǎo)致病毒變異這一情況未能在本實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)，因此序貫療法能否長(zhǎng)時(shí)間在人體內(nèi)有這種實(shí)驗(yàn)學(xué)現(xiàn)象仍需進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分支持了基于“路線圖”聯(lián)合治療，及序貫治療的有效性和可行性。但在臨床治療應(yīng)用時(shí)，患者體質(zhì)狀況、病毒的變異程度、治療費(fèi)用對(duì)患者依從性的影響及社會(huì)的費(fèi)用效益比等，都影響治療方案的選擇，所以在臨床治療時(shí)，我們應(yīng)綜合各種因素判斷，慎重選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ā?/p>

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(責(zé)任編輯：王全楚)

The effect on replication of HBV DNA in HepG2.2.15 cells by the sequential treatment with Entecavir following interferon α-2b

YANG Wei,ZHAO Chao,LI Jing,DING Yang,WANG Xue

Department of Infectious Disease,the 89th Hospital of PLA,Weifang 261021,China

Objective To investigate the effect on replication of HBV DAN in HepG2.2.15 cells by the sequential treatment with Entecavir (ETV) following interferon α-2b (IFNα-2b). Methods In individual groups,HepG2.2.15 cells were treated with various concentrations of ETV (1.5 μg/ml,5 μg/ml,10 μg/ml) and IFNα-2b (5 000 IU/ml,10 000 IU/ml,15 000 IU/ml) individually; in combination group,HepG2.2.15 cells were treated with ETV and IFNα-2b combination; in sequential groups,HepG 2.2.15 cells were treated with ETV following IFNα-2b. The method of determined proliferation was MTT; HBV DNA copies were detected by Real time PCR-fluorescence probing in one-tube method from the supermatant of HepG 2.2.15 cells; HBsAg and HBeAg expressions from the supermatant were measured by ELISA at different time points. Results Compared with the individual groups or the combination group,sequential group had more powerful inhibition effects on HBV DNA replication,the more powerful inhibition expressions of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells. Conclusion The sequential treatment with ETV following IFNα-2b has more powerful effect on replication of HBV DNA than the individual treatment or combination treatment.

Entecavir; Interferon α-2b; HepG2.2.15 cells; HBV DNA; Sequential treatment

楊偉，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肝病。E-mail：ywcyw723@sina.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.012

R512.6+2

A

1006-5709(2016)04-0408-03

2015-09-20