表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯調(diào)控食管癌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用研究

劉亮　巨英超　左靜　曲藝　尤殿平

050011　石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細(xì)胞室(劉亮、巨英超、左靜)；河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所(曲藝)；河北省衛(wèi)生醫(yī)學(xué)科技發(fā)展研究中心(尤殿平)

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·論著·

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯調(diào)控食管癌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用研究

劉亮巨英超左靜曲藝尤殿平

050011石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細(xì)胞室(劉亮、巨英超、左靜)；河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所(曲藝)；河北省衛(wèi)生醫(yī)學(xué)科技發(fā)展研究中心(尤殿平)

【摘要】目的探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)調(diào)控食管癌細(xì)胞Ec9706線(xiàn)粒體膜電位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。方法不同濃度(100、200、300 mg/L) EGCG作用Ec9706細(xì)胞24 h后，Annexin V/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位；Western Blot 方法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平，0.9%氯化鈉溶液代替EGCG作為對(duì)照組。結(jié)果100、200、300 mg/L EGCG作用Ec9706細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比Ec9706細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)，300 mg/L EGCG組細(xì)胞凋亡率顯著高于100、200 mg/L EGCG組(P<0.01)。EGCG可顯著降低細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位(P<0.01)，且具有劑量依賴(lài)性。western-blot結(jié)果顯示，EGCG組與對(duì)照組相比Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。結(jié)論EGCG具有誘導(dǎo)食管癌Ec9706細(xì)胞凋亡作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控線(xiàn)粒體膜電位引起內(nèi)源性細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；食管癌；細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)

綠茶具有防癌和抗癌的功效，茶多酚是其起功效的主要成分，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是綠茶提取物中主要的酚類(lèi)化合物。EGCG是從中國(guó)綠茶中提取的一種成分，也是綠茶主要的活性和水溶性成分，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%。研究顯示，EGCG具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗紫外線(xiàn)、預(yù)防心血管疾病等功效[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG2還具有抗腫瘤活性[5-8]，引起研究者高度重視，EGCG具有低毒副作用的特點(diǎn)，如果能將其開(kāi)發(fā)為抗腫瘤藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。食管癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高，河北省是食管癌的高發(fā)區(qū)，尤其是邯鄲的磁縣，食管癌發(fā)病和病死率較高，嚴(yán)重威脅了人們的生命健康，多數(shù)就診患者已是中晚期，常規(guī)的手術(shù)及放化療效果不佳，尋找高效低毒的抗食管癌藥物顯得十分重要。本課題探討EGCG是否具有抗食管癌作用，利用食管癌細(xì)胞Ec9706，較系統(tǒng)地研究EGCG調(diào)控Ec9706細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制，為臨床上尋找高效低毒的抗食管癌藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器:EGCG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，若丹明123(Rhodanmine 123, Rho 123)試劑購(gòu)自solarbio公司，兔抗人Caspase-3抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。Epics-XL型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.1.2細(xì)胞株:人食管癌Ec9706細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中(補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100 U/L)，培養(yǎng)器皿置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec9706細(xì)胞1×106接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的EGCG，使終濃度分別達(dá)到0、100、200、300 mg/L，對(duì)照組使用0.9%氯化鈉溶液代替EGCG(0 mg/L EGCG)，作用24 h后，收集細(xì)胞，PBS液洗滌2次，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾制備成合格的單細(xì)胞懸液。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取上述制備的單細(xì)胞懸液1 ml(含1×106細(xì)胞)。冷PBS洗滌細(xì)胞1次，100 μl冷1×binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-FITC，冰上避光放置15 min，加入380 μl 1×binding buffer，加入10 μl PI染液冰上避光放置15 min，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，1 ml PBS懸浮細(xì)胞后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。應(yīng)用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，計(jì)算早期細(xì)胞凋亡率及晚期細(xì)胞凋亡率。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位:取上述制備的單細(xì)胞懸液1 ml(含1×106細(xì)胞)，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，100 μl PBS液懸浮細(xì)胞，加入Rho 123染料，使最終濃度達(dá)到10 μg/ml，在37℃下避光平衡30 min，PBS洗滌細(xì)胞1次后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。應(yīng)用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，以平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平。

1.2.4western-blot方法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平:取上述制備單細(xì)胞懸液，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，離心去上清，使用RIPA試劑常規(guī)方法提取細(xì)胞蛋白。取30 μg蛋白與1×上樣緩沖液按1∶4的比例加樣，于8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TTBS液封閉，4℃過(guò)夜，TTBS液洗膜后加Caspase-3一抗(1∶200) 進(jìn)行雜交，再度洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶2 000)進(jìn)行雜交，最后洗膜后加入DAB液進(jìn)行條帶顯色，其中β-actin為內(nèi)參照。對(duì)條帶進(jìn)行掃描，并用Gel-Pro Analyzer 3.1軟件分析條帶的OD，計(jì)算Caspase-3條帶OD/β-actin條帶OD，作為Caspase-3的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞凋亡水平流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度(100、200、300 mg/L)EGCG作用Ec9706細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率分別為(7.01±0.54)%、(15.12±0.98)%、(21.07±1.27)%，與對(duì)照組(0.56±0.08)%相比細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)，且具有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1、2。

圖1　不同濃度EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞凋亡

圖2　4組細(xì)胞凋亡率比較

2.2EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平100、200、300 mg/L EGCG組Ec9706細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平分別為(347±16)、(286±22)、(164±17) 與對(duì)照組 (406±12) 相比顯著降低(P<0.01)，且隨著EGCG濃度增加，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位水平也呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。見(jiàn)圖3、4。

圖3　不同濃度EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平

圖4EGCG組與對(duì)照組相比，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平顯著降低，且具有劑量依賴(lài)性

2.3EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平100、200、300 mg/L EGCG組Ec9706細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)量分別為(0.40±0.03)、(0.53±0.06)、(0.68±0.05),與對(duì)照組(0.28±0.05)相比顯著增高(P<0.01)，且隨著EGCG濃度增加，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)量也呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì)，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5、6。

2.4EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞凋亡水平與線(xiàn)粒體膜電位水平相關(guān)性分析EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞凋亡水平與線(xiàn)粒體膜電位水平呈顯著負(fù)相關(guān)性(pearson相關(guān)系數(shù)=-0.953，P=0.000)。

3討論

綠茶具有防癌作用，本課題主要探討綠茶中主要提取物EGCG抗食管癌作用及其相關(guān)機(jī)制，為臨床上尋找高效、低毒的抗食管癌藥物及為研究EGCG抗癌作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。EGCG是茶多酚中最有效的活性成分，屬于兒茶素，EGCG是從中國(guó)綠茶中提取的一種成分，是綠茶主要的活性和水溶性成分，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%。EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎及抗腫瘤作用，尤其在抗腫瘤作用方面，目前得到了廣泛的研究。大量的研究顯示了EGCG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用[9-12]或?qū)熕幬锏脑雒糇饔肹13,14]。研究顯示，EGCG抗腫瘤作用機(jī)制多圍繞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、引起細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬等方面[15-17]，而且研究顯示，EGCG對(duì)腫瘤干細(xì)胞也具有生長(zhǎng)抑制作用[18]。EGCG來(lái)源于綠茶，是綠茶的提取物，具有低毒副作用的特點(diǎn)，如果能將其開(kāi)發(fā)為光譜的抗腫瘤藥物，將會(huì)具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖5　不同濃度EGCG作用Ec9706細(xì)胞后細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)

圖6　4組Caspase-3蛋白表達(dá)量比較

食管癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病及病死率較高，我國(guó)食管癌高發(fā)，尤其是河北的磁縣及河南的林州食管癌發(fā)病及病死率較高，威脅了人們的生活健康。目前食管癌的常規(guī)治療包括手術(shù)、化療及放療，對(duì)于晚期或不能手術(shù)者，往往選擇放療及化療，目前由于化療藥物的高毒副作用及耐藥的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了其治療效果，最終導(dǎo)致化療失敗。尋找高效低毒的抗食管癌藥物顯得格外重要。綠茶是人們常用飲品，具有安全無(wú)毒的特點(diǎn)，如能將其提取物EGCG用于抗癌藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。目前研究顯示，EGCG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用[19,20]，但在食管癌中的研究較少，且缺乏系統(tǒng)的機(jī)制研究，本課題通過(guò)觀(guān)察EGCG是否對(duì)Ec9706細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位有影響，研究其是否能夠通過(guò)線(xiàn)粒體膜電位的內(nèi)源性凋亡通路引起食管癌細(xì)胞凋亡，為臨床上食管癌治療提高高效、低毒的抗食管癌藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡間的平衡維持著正常細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡的異常往往會(huì)引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，因此，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是目前新藥物研發(fā)評(píng)價(jià)藥物療效的主要指標(biāo)。細(xì)胞凋亡途徑包括，外部途徑，通過(guò)胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase；另一條通路是內(nèi)部途徑，通過(guò)線(xiàn)粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。內(nèi)源性凋亡途徑是目前研究藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡常用的途徑[21]。在本實(shí)驗(yàn)中首先觀(guān)察到了EGCG對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和直接殺傷作用，這些結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的AnnexinV-PI雙染方法進(jìn)行，可以同時(shí)檢測(cè)到了細(xì)胞凋亡及壞死的細(xì)胞比例，且EGCG對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用具有劑量依賴(lài)性，隨著EGCG濃度的增加，EGCG誘導(dǎo)Ec9706細(xì)胞凋亡率也隨之增加，這樣奠定了EGCG具有抗食管癌作用基礎(chǔ)，接下來(lái)進(jìn)一步研究EGCG對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。通過(guò)研究細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示，EGCG可以降低細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位，線(xiàn)粒體膜電位的減低可以使誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子(如細(xì)胞色素C等)釋放從而激活Caspase-3等蛋白，引起細(xì)胞凋亡，且EGCG降低細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位水平具有EGCG濃度依賴(lài)性，隨著EGCG濃度的增加，EGCG降低Ec9706細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位水平也隨之增加。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，EGCG組Ec9706細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增高，且具有EGCG的濃度依賴(lài)性。這些結(jié)果與線(xiàn)粒體凋亡的內(nèi)源性凋亡途徑因子變化趨勢(shì)一致。

綜合上述的研究結(jié)果，提示，EGCG可以誘導(dǎo)Ec9706細(xì)胞凋亡及直接殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與降低線(xiàn)粒體膜電位及升高Caspase-3蛋白表達(dá)水平有關(guān)。EGCG具有低毒、價(jià)廉的特點(diǎn)，如果能將其開(kāi)發(fā)為抗食管癌藥物，將具有廣泛的應(yīng)用前景。

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Epigallocatechin-3-gallate induced Ec9706 cell apoptosis by regulating the mitochondrial transmembrane potential

LIULiang,JUYingchao,ZUOJing,etal.

DepartmentofFCM,ResearchinstituteofOncology,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of and action mechanism of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in inducing cell apoptosis of esophageal cancer (Ec9706 cell) through regulating mitochondrial transmembrane potential.MethodsThe Ec9706 cells were treated by different doses of EGCG (100,200,300mg/L) for 24h,then the cell apoptosis rates were detected by AnnexinV/PI staining. The mitochondrial transmembrane potential was measured by flow cytometry.Moreover the expression levels of Caspase-3 protein were detected by Western Blot. Normal saline instead of EGCG was used as control group.ResultsAfter Ec9706 cells were treated by different doses of EGCG (100,200,300mg/L) for 24h,the cell apoptosis rates in EGCG groups were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05), moreover, which in 300mg/L EGCG group were significantly higher than those in 100mg/L and 200mg/L EGCG group (P<0.01). EGCG could obviously decrease mitochondrial transmembrane potential (P<0.01),with a dose-dependent manner. The results by Western Blot showed that the expression levels of Caspase-3 protein in EGCG groups were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05).ConclusionEGCG has the effects of inducing Ec9706 cell apoptosis,and its action mechanism may be correlated to regulating mitochondrial transmembrane potential to induce endogenous cell apoptosis.

【Key words】epigallocatechin-3-gallate; esophageal cancer; cell apoptosis; flow cytometry

(收稿日期：2015-10-20)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 735.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)10-1457-04

通訊作者：尤殿平，050000河北省衛(wèi)生醫(yī)學(xué)科技發(fā)展研究中心；

doi:10.3969/j.iss n.1002-7386.2016.10.004

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20150345;20160167)；河北省普通高等學(xué)校強(qiáng)勢(shì)特色學(xué)科腫瘤學(xué)建設(shè)經(jīng)費(fèi)[冀教高(2005)52號(hào)]

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