MEF2C介導(dǎo)microRNA-214發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用*

唐春梅， 朱杰寧， 朱文思1, ， 林秋雄， 胡志琴， 符永恒， 張夢(mèng)珍， 鄧春玉，譚虹虹， 吳書(shū)林， 單志新△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州510515； 2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

·論 著·

MEF2C介導(dǎo)microRNA-214發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用*

唐春梅1,2， 朱杰寧2， 朱文思1, 2， 林秋雄2， 胡志琴1,2， 符永恒2， 張夢(mèng)珍2， 鄧春玉2，譚虹虹2， 吳書(shū)林2， 單志新2△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州510515；2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

目的： 研究微小RNA-214(miR-214)對(duì)心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用及其可能的作用靶基因。方法: 建立血管緊張素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)誘導(dǎo)的C57BL/6乳小鼠心室肌細(xì)胞肥大模型；雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-214與潛在靶基因MEF2C3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的結(jié)合作用；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR) 和Western blot 法分別檢測(cè)MEF2C及肥厚標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 心肌肥厚標(biāo)志物ANP、ACTA1和β-MHC，以及miR-214的表達(dá)在Ang-II誘導(dǎo)肥大的小鼠心肌細(xì)胞中顯著增強(qiáng)；雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示miR-214與MEF2C3’UTR相互作用，證實(shí)miR-214可在轉(zhuǎn)錄水平抑制MEF2C的表達(dá)，MEF2C蛋白水平在肥大的心肌細(xì)胞中顯著上調(diào)；過(guò)表達(dá)miR-214及沉默MEF2C均能一致性地抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中肥大標(biāo)志物的表達(dá)。 結(jié)論:MEF2C是miR-214的靶基因，并介導(dǎo)了miR-214發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

心肌肥厚； 微小RNA-214； MEF2C； 心肌細(xì)胞

心肌肥厚是心肌重構(gòu)的重要組成部分，是心血管疾病最為常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。心肌肥厚是心肌對(duì)包括機(jī)械刺激、激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或壓力負(fù)荷增加等刺激作用下的代償性適應(yīng)。心肌肥厚時(shí)心肌標(biāo)志蛋白表達(dá)水平升高，發(fā)生心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)伴隨有心肌細(xì)胞外間質(zhì)增多、心臟重量增加，還伴有心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化以及心肌間質(zhì)纖維化等病理改變，病理性心肌肥厚最終將導(dǎo)致心肌病和心衰[1]。盡管人們開(kāi)展心肌肥厚的相關(guān)研究已有幾十年，但對(duì)于心肌肥大發(fā)生和維持的確切機(jī)制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛存在于動(dòng)植物中，是一類(lèi)內(nèi)源性的18～25個(gè)堿基的非編碼單鏈RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，與靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)序列相互識(shí)別，抑制相應(yīng) mRNAs的翻譯或降解特異mRNAs,其主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[2-3]。越來(lái)越多的研究表明，心肌肥厚時(shí)miRNAs表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，一些miRNAs參與了心肌肥厚的病理過(guò)程，并發(fā)揮著重要作用[4-7]。已有研究顯示[8-11]，miR-1、miR-208a、miR-195和miR-199a-5p在心肌肥厚時(shí)均上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-208a或miR-195的轉(zhuǎn)基因小鼠，給予其促肥厚處理后，其心臟病理情況更為明顯,給予心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-1或過(guò)表達(dá)miR-199a-5p處理后，心肌細(xì)胞也發(fā)生明顯的肥大。與之相反，心肌肥厚時(shí)，miR-150和miR-181b表達(dá)顯著下調(diào)，且對(duì)心肌細(xì)胞給予過(guò)表達(dá)miR-150或 miR-181b處理之后，心肌細(xì)胞表面積會(huì)明顯減小[10]。心肌肥厚時(shí)，miR-214的表達(dá)也發(fā)生顯著改變[12]，提示miR-214可能參與了心肌肥厚的過(guò)程。然而，miR-214在心肌肥厚中的的作用機(jī)制目前仍不明確，本研究旨在探討miR-214調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、EcoR I、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和4×SDS loa-ding buffer(Invitrogen)；2×SYBR Green Mix和RNase free water(TaKaRa)；miR-214 mimic和MEF2CsiRNA(廣州銳博)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(碧云天)；GAPDH Ⅰ抗、 ACTA1 Ⅰ抗和Ⅱ抗(Protein Technology)；抗ANP抗體(Abcam)；抗β-MHC 抗體(Sigma)；蛋白Marker(Fermentas)； PVDF膜(Whatman)； ECL發(fā)光液(Bioword)；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone)；特級(jí)澳洲胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶粉末(廣州威佳科技有限公司)。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 乳小鼠心肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)及處理 取出生1～3 d SPF級(jí)C57BL/6乳小鼠心臟，以0.25%胰蛋白酶消化法原代分離細(xì)胞。乳小鼠心室肌細(xì)胞(neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs)與成纖維細(xì)胞由于貼壁速度不同而得以分離，收集上清中心肌細(xì)胞，將其接種于提前用1 %明膠包被過(guò)的12孔板中，用含有10 %胎牛血清及1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，更換1次完全培養(yǎng)基至穩(wěn)定培養(yǎng)48 h。采用10-8mol/L血管緊張素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生肥大。分別將50 nmol/L scramble對(duì)照、miR-214 mimic和MEF2CsiRNA轉(zhuǎn)染小鼠心肌細(xì)胞，24 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.2 FITC-鬼筆環(huán)肽(FITC-phallodin)染色 將NMVCs鋪在預(yù)先放置了無(wú)菌圓形玻片的12孔板中。穩(wěn)定生長(zhǎng)后吸掉培養(yǎng)基，用PBS漂洗2次，加入500 μL的4%的多聚甲醛溶液固定，再用2 g/L的甘氨酸溶液中和多聚甲醛，搖床孵育2次，每次5 min。將10 mg/L的FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染料37 ℃孵育40 min，用1×PBS漂洗2次，再行Hoechst 33342反應(yīng)液，避光37 ℃孵育40 min。將細(xì)胞爬片倒扣置另一個(gè)滴有30 μL防熒光淬滅封片劑的載玻片上，在倒置熒光顯微鏡下觀察F-actin被染色后顯示出細(xì)胞輪廓。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肥厚相關(guān)基因、MEF2C以及miR-214表達(dá) 用TRIzol試劑提取心肌細(xì)胞總RNA。取2.0 μg總RNA，加入5×的逆轉(zhuǎn)錄試劑4 μL(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，用oligo (dT)15和random primers逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于檢測(cè)編碼基因mRNA水平。取1.0 μg總RNA，用miR-214特異的RT引物逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于檢測(cè)miR-214水平。分別用GAPDH和U6作為檢測(cè)編碼基因和miR-214表達(dá)水平的內(nèi)參照。在ViiATM7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR反應(yīng)和結(jié)果分析。以2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因和miR-214的相對(duì)表達(dá)水平。本文所用PCR引物序列見(jiàn)表1。

2.4 Western blot 法檢測(cè)蛋白水平 收集處理后的心肌細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白定量后分裝，加入4×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用相應(yīng)的抗體anti-ANP (1∶5 000)和anti-β-MHC(1∶1 000)、anti-ACTA1(1∶5 000)、anti-MEF2C(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加II抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達(dá)相對(duì)含量。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse.

2.5 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-214與MEF2C3’UTR的結(jié)合作用 參照我們已報(bào)道方法[13]分別構(gòu)建包含miR-214潛在結(jié)合序列的MEF2C3’UTR重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-MEF2C-bs及包含結(jié)合序列突變的重組質(zhì)粒pGL3-MEF2C-bs-MUT。利用HEK293細(xì)胞，將HEK293細(xì)胞(細(xì)胞密度約為每孔1×105)轉(zhuǎn)染200 ng重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，50 nmol/L miR-214 mimic以及10 ng pRL-TK(表達(dá)海腎螢光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染后24 h，測(cè)定螢火蟲(chóng)螢光素酶(firefly luciferase, FL)及海腎螢光素酶(Renillaluciferase, RL)強(qiáng)度，兩種熒光強(qiáng)度比值(FL/RL)變化可反映miR-214與MEF2C3’UTR結(jié)合的能力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-214 在肥大的心肌細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)

FITC-phallodin染色結(jié)果顯示10-8mol/L Ang-Ⅱ處理48 h后的NMVCs 發(fā)生顯著的心肌細(xì)胞肥大。與空白組相比，Ang-Ⅱ處理的NMVCs中肥厚標(biāo)志物ANP、ACTA1及β-MHC的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果表明Ang-Ⅱ能夠成功誘導(dǎo)NMVCs出現(xiàn)肥大表型。同時(shí)， RT-qPCR結(jié)果顯示miR-214在發(fā)生肥大的NMVCs中表達(dá)亦顯著增加，見(jiàn)圖1。

2MEF2C是miR-214 作用靶基因的驗(yàn)證

基于miRDB(www.mirdb.org)以及TargetScan-Vert (www.targetscan.org)的序列分析提示，MEF2C3’UTR的4 372～4 378堿基可能是miR-214的結(jié)合位點(diǎn)。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示miR-214可特異地結(jié)合到MEF2C3’UTR的4 372～4 378位點(diǎn)，而突變結(jié)合區(qū)序列后，miR-214就不能與MEF2C3’UTR結(jié)合。RT-qPCR 和Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，MEF2C在Ang-II誘導(dǎo)的肥大NMVCs中表達(dá)明顯增強(qiáng)，而miR-214 mimic和MEF2CsiRNA能一致性地在mRNA和蛋白水平抑制NMVCs中MEF2C表達(dá)，見(jiàn)圖2。

3 過(guò)表達(dá)miR-214及沉默MEF2C可有效抑制心肌細(xì)胞肥大基因的表達(dá)

為從功能上鑒定過(guò)表達(dá)miR-214與抑制MEF2C對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響，分別將50 nmol/L miR-214 mimic和MEF2CsiRNA轉(zhuǎn)染入Ang-II誘導(dǎo)的NMVCs中。Western blot結(jié)果顯示，miR-214 mimic和MEF2CsiRNA能一致性地抑制Ang-II誘導(dǎo)NMVCs中ACTA1和β-MHC的表達(dá)增加，見(jiàn)圖3。

Figure 1.miR-214 was increased in the myocardium of a mouse model of hypertrophy induced by Ang-II infusion. A: FITC-phalloidin staining assay; B: the mRNA expression of hypertrophy-related genes was determined by RT-qPCR; C: the protein expression of ANP, ACTA1 and β-MHC was determined by Western blot; D: the expression of miR-214 was assessed by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group.

圖1 miR-214在Ang-II誘導(dǎo)的肥厚小鼠心肌中表達(dá)增強(qiáng)

討 論

近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在小鼠心肌缺血再灌注時(shí)的表達(dá)顯著升高；而miR-214敲除小鼠在缺血再灌注損傷7 d 后發(fā)生心肌肥厚和心肌纖維化程度明顯加重。機(jī)制研究證實(shí)，miR-214可通過(guò)抑制鈉鈣交換體1(Na+/Ca2+exchanger 1，Ncx1)而抑制Ca2+通道功能，從而抑制缺血損傷所致的Ca2+超載及細(xì)胞死亡，進(jìn)而有效抑制小鼠缺血性心肌損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[14]。miR-214在H2O2處理的心肌細(xì)胞中亦表達(dá)上調(diào)，而PTEN是miR-214的作用靶基因，并介導(dǎo)miR-214發(fā)揮抗H2O2所致的心肌細(xì)胞凋亡作用[15]。

既往研究顯示miR-214也參與了心肌肥厚的病理過(guò)程。在小鼠心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-214，能顯著上調(diào)心肌肥厚標(biāo)志物ANP、ACTA1及β-MHC表達(dá)，而EZH2可能介導(dǎo)了miR-214的促心肌肥厚作用；在miR-214的轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中ANP、ACTA1及β-MHC表達(dá)上調(diào)，并且抑制miR-214表達(dá)能有效下調(diào)橫向主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)所致的ANP、ACTA1及β-MHC表達(dá)增加[16-17]。

本文中，我們證實(shí)miR-214在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)肥大的小鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)升高。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示miR-214可與MEF2C 3’UTR特異性結(jié)合。而檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-214的NMVCs中MEF2C水平發(fā)現(xiàn)，miR-214可在轉(zhuǎn)錄水平抑制MEF2C表達(dá)。進(jìn)一步的功能性研究表明，miR-214和MEF2CsiRNA可一致性地抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的NMVCs中心肌肥大相關(guān)ACTA1和β-MHC表達(dá)。因此，上述結(jié)果證實(shí)MEF2C是miR-214的靶基因，并介導(dǎo)miR-214發(fā)揮抑制心肌肥大的作用。

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)家族蛋白是一類(lèi)具有調(diào)節(jié)功能的蛋白,包括MEF2A、2B、2C和2D[18-19]。MEF2C在心臟中高表達(dá)，作為心臟特異的轉(zhuǎn)錄因子參與心臟發(fā)育的各個(gè)過(guò)程，調(diào)節(jié)著心臟特異基因的表達(dá)，敲除后會(huì)對(duì)心臟及血管的發(fā)育造成嚴(yán)重不良影響[20-21]。而MEF2C也被證實(shí)參與心肌肥厚的過(guò)程，MEF2C在發(fā)生心肌肥厚時(shí)被激活并且表達(dá)上調(diào)[22]。當(dāng)特異性抑制心肌MEF2C表達(dá)后，能夠有效減輕壓力負(fù)荷所至的小鼠左室肥厚[23]。本文結(jié)果也表明，MEF2C在Ang-II誘導(dǎo)肥大的心肌細(xì)胞中特異地表達(dá)升高，而沉默MEF2C表達(dá)可有效抑制Ang-II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

本文結(jié)果提示miR-214可通過(guò)抑制MEF2C表達(dá)發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，與以往miR-214通過(guò)抑制EZH2發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的報(bào)道不一致[16-17]。目前關(guān)于EZH2調(diào)控心肌細(xì)胞肥大作用的觀點(diǎn)尚不一致，有研究證實(shí)，增加EZH2穩(wěn)定性和生物學(xué)功能可顯著抑制心肌肥厚的發(fā)生[24]。

Figure 2.miR-214 modulated the expression of MEF2C at the transcriptional level. A: dual luciferase reporter assay; B: MEF2C expression in NMVCs exposed to Ang-Ⅱ; C: MEF2C expression in NMVCs treated with miR-214 mimic orMEF2CsiRNA. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vspGL3-promoter group;△P<0.05,△△P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsscramble group.

圖2 miR-214在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MEF2C表達(dá)

Figure 3.miR-214 andMEF2CsiRNA inhibited the expression of hypertrophy-related proteins in the NMVCs. The protein expression of ACTA1, β-MHC and MEF2C in NMVCs was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsAng-II group.

圖3 miR-214和MEF2CsiRNA抑制乳小鼠心肌細(xì)胞中肥厚相關(guān)基因表達(dá)

本文發(fā)現(xiàn)miR-214在肥大的心肌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、靶基因表達(dá)和相應(yīng)功能性實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEF2C是miR-214作用靶基因，介導(dǎo)miR-214發(fā)揮抗心肌細(xì)胞肥大作用。在后續(xù)研究中，我們將在小鼠整體水平，進(jìn)一步明確miR-214對(duì)MEF2C表達(dá)和對(duì)心肌肥厚表型的調(diào)控作用。

[1] Chien KR, Grace AA, Hunter JJ. Molecular and cellular biology of cardiac hypertrophy and failure[M]// Chien KR. Molecular basis of cardiovascular disease. Philadelphia: Saunders, 1999:211-250.

[2] Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, et al. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles inCaenorhabditiselegans[J]. Science, 2001, 294(5543):858-862.

[3] Lim LP, Glasner ME, Yekta S, et al. Vertebrate micro-RNA genes[J]. Science, 2003, 299(5612):1540.

[4] Da Costa Martins PA, De Windt LJ. MicroRNAs in control of cardiac hypertrophy[J]. Cardiovasc Res, 2012, 93(4):563-572.

[5] van Rooij E, Sutherland LB, Liu N, et al. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(48):18255-18260.

[6] Sayed D, Hong C, Chen IY, et al. MicroRNAs play an essential role in the development of cardiac hypertrophy[J]. Circ Res, 2007,100(3):416-424.

[7] Cheng Y, Ji R, Yue J, et al. MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart: do they play a role in cardiac hypertrophy? [J]. Am J Pathol, 2007, 170(6):1831-1840.

[8] Yuan W, Tang C, Zhu W, et al. CDK6 mediates the effect of attenuation of miR-1 on provoking cardiomyocyte hypertrophy[J]. Mol Cell Biochem, 2016, 412(1-2):289-296.

[9] Callis TE, Pandya K, Seok HY, et al. MicroRNA-208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice[J]. J Clin Invest, 2009, 119(9):2772-2786.

[10]van Rooij E, Sutherland LB, Liu N, et al. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(48):18255-18260.

[11]張振輝,黎 佼,熊旭明,等. 微小RNA-199a-5p調(diào)控大鼠心肌細(xì)胞肥大的研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014,30(3):408-413.

[12]Ono K, Kuwabara Y, Han J. MicroRNAs and cardiovascular diseases [J]. FEBS J, 2011, 278(10):1619-1633.

[13]Shan ZX, Lin QX, Deng CY, et al. miR-1/miR-206 regulate Hsp60 expression contributing to glucose-mediated apoptosis in cardiomyocytes[J]. FEBS Lett, 2010, 584(16):3592-3600.

[14]Lv G, Shao S, Dong H, et al. MicroRNA-214 protects cardiac myocytes against H2O2-induced injury[J]. J Cell Biochem, 2014, 115(1):93-101.

[15]Aurora AB, Mahmoud AI, Luo X, et al. MicroRNA-214 protects the mouse heart from ischemic injury by controlling Ca2+overload and cell death[J]. J Clin Invest, 2012,122(4):1222-1232.

[16]Yang T, Zhang GF, Chen XF, et al. MicroRNA-214 provokes cardiac hypertrophy via repression of EZH2[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 436(4):578-584.

[17]Yang T, Gu HH, Chen XF, et al. Cardiac hypertrophy and dysfunction induced by overexpression of miR-214invivo[J]. J Surg Res, 2014, 192(2):317-325.

[18]Black BL, Olson EN. Transcriptional control of muscle development by myocyte enhancer factor 2 (MEF2) proteins [J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 1998, 14:167-196.

[19]McKinsey TA, Zhang CL, Olson EN. MEF2: a calcium-dependent regulator of cell division, differentiation and death[J]. Trends Biochem Sci, 2002, 27(1):40-47.

[20]Edmondson DG, Lyons GE, Martin JF, et al.Mef2 gene expression marks the cardiac and skeletal muscle lineages during mouse embryogenesis [J]. Development, 1994, 120(5):1251-1263.

[21] Lin Q, Schwarz J, Bucana C, et al.Control of mouse cardiac morphogenesis and myogenesis by transcription factor MEF2C[J]. Science, 1997, 276(5317):1404-1407.

[22] Zhang ZY, Liu XH, Hu WC, et al. The calcineurin-myocyte enhancer factor 2C pathway mediates cardiac hypertrophy induced by endoplasmic reticulum stress in neonatal rat cardiomyocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 298(5): H1499-H1509.

[23] Pereira AH, Clemente CF, Cardoso AC, et al. MEF2C silencing attenuates load-induced left ventricular hypertrophy by modulating mTOR/S6K pathway in mice [J]. PLoS One, 2009, 4(12):e8472.

[24]Mathiyalagan P, Okabe J, Chang L, et al. The primary microRNA-208b interacts with polycomb-group protein, EZH2, to regulate gene expression in the heart [J]. Nucleic Acids Res,2014, 42(2):790-803.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

MEF2C mediates inhibitory effect of microRNA-214 on cardiomyocyte hypertrophy

TANG Chun-mei1, 2, ZHU Jie-ning2, ZHU Wen-si1, 2, LIN Qiu-xiong2, HU Zhi-qin1, 2, FU Yong-heng2, ZHANG Meng-zhen2, DENG Chun-yu2, TAN Hong-hong2, WU Shu-lin2, SHAN Zhi-xin1, 2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2GuangdongCardiovascularInstitute,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:zhixinshan@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-214 (miR-214) on cardiomyocyte hypertrophy and the expression of the potential target genes. METHODS: A cell model of hypertrophy was established based on angiotensin-Ⅱ (Ang-Ⅱ)-induced neonatal mouse ventricular cardiomyocytes (NMVCs). Dual luciferase reporter assay was performed to verify the interaction between miR-214 and the 3’UTR ofMEF2C. The expression of MEF2C and hypertrophy-related genes at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively.RESULTS: The expression of ANP, ACTA1, β-MHC and miR-214 was markedly increased in Ang-Ⅱ-induced hypertrophic cardiomyocytes. Dual luciferase reporter assay revealed that miR-214 interacted with the 3’UTR ofMEF2C, and miR-214 was verified to inhibit MEF2C expression at the transcriptional level. The protein expression of MEF2C was markedly increased in the hypertro-phic cardiomyocytes. Moreover, miR-214 mimic, in parallel toMEF2CsiRNA, inhibited the expression of hypertrophy-related genes in Ang-Ⅱ-induced NMVCs. CONCLUSION:MEF2Cis a target gene of miR-214, which mediates the effect of miR-214 on attenuating cardiomyocyte hypertrophy.

Cardiac hypertrophy; MicroRNA-214; MEF2C; Cardiomyocytes

1000- 4718(2016)08- 1345- 06

2016- 04- 05

2016- 05- 13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270222；No. 81470439)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313635)； 廣東省醫(yī)學(xué)研究基金資助項(xiàng)目 (No. A2015187)

R329.2+1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.001

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 020-83827812-51158； E-mail: zhixinshan@aliyun.com