雙重實時熒光定量PCR檢測人維生素D受體的方法學構(gòu)建

喻妙梅，于洋，張俊，姚霜，潘麗莉，羅光華

?

雙重實時熒光定量PCR檢測人維生素D受體的方法學構(gòu)建

喻妙梅，于洋，張俊，姚霜，潘麗莉，羅光華△

摘要：目的建立單管檢測人維生素D受體（VDR）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的雙重實時熒光定量聚合酶鏈反應（dual real-time PCR）的方法。方法以GAPDH基因為內(nèi)參，采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物及TaqMan探針，進行PCR擴增檢測VDR基因。將VDR及GAPDH擴增產(chǎn)物片段純化后克隆構(gòu)建成重組質(zhì)粒，作為定量檢測基因表達的標準品，并用于分析該方法的靈敏度和重復性。結(jié)果PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析證實為VDR及GAPDH特異性片段；該方法檢測VDR與GAPDH靈敏度達40拷貝/μL；線性范圍為4.00×101～4.00×105拷貝/μL；決定系數(shù)R2分別為0.998、0.999；擴增效率E分別為96.10%、85.15%；批內(nèi)變異系數(shù)（CV）分別為0.09%～ 1.21%、0.35%～0.88%；批間CV分別為0.17%～0.51%、0.51%～2.46%。結(jié)論成功建立了單管檢測人VDR及GAPDH的雙重實時熒光定量PCR方法，且該方法特異性好、靈敏度高、可快速高通量檢測VDR的相對表達量，有效縮短時間，減小實驗誤差。

關鍵詞：受體，骨化三醇；聚合酶鏈反應；甘油醛-3-磷酸脫氫酶類；維生素D受體；雙重實時熒光定量PCR

△通訊作者E-mail：shineroar@163.com

維生素D受體（vitamin D receptor, VDR）為親核蛋白，是介導1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應的核內(nèi)生物大分子，屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員。VDR廣泛分布于人體各組織細胞中，其中結(jié)腸、腎臟、骨骼等部位及淋巴細胞中的表達尤為顯著[1]。VDR是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，主要通過介導基因轉(zhuǎn)錄而調(diào)控蛋白合成。它在維持機體礦物質(zhì)動態(tài)平衡、鈣磷代謝、骨代謝、調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和免疫等方面起重要作用[2]。因單熒光實時定量PCR在檢測多個基因時需要多管反應體系，試劑耗費多且耗時長。另外，在定量研究靶基因表達水平時，必須有內(nèi)參基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）基因的參與，通過靶基因與內(nèi)參基因表達量的比來消除標本間RNA提取時的取樣誤差。如果用單熒光實時定量PCR檢測靶基因和內(nèi)參基因，需要分兩管進行，會在模板（cDNA）加樣環(huán)節(jié)產(chǎn)生加樣誤差。為避免此誤差并減少PCR次數(shù)，本研究構(gòu)建了單管檢測VDR及GAPDH基因表達的雙重實時熒光定量PCR（dual real-time PCR）的方法，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料實時熒光定量PCR擴增儀（Light Cycler 480Ⅱ，Roche公司），核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司），臺式高速冷凍離心機（5804R，Eppendorf公司），脂肪組織總RNA提取試劑盒（QIAGEN公司），cDNA首鏈合成試劑盒（Thermo Fisher公司），Immolasetm DNA Polymerase（Bioline公司）。

1.2方法

1.2.1引物及探針的設計與合成在GenBank中查找VDR （NM_001017535）和GAPDH（NM_001289745）的堿基序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物及TaqMan探針，引物和探針序列均委托生工生物工程（上海）有限公司合成，見表1。

1.2.2脂肪組織總RNA制備取剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦腹部皮下脂肪組織約黃豆大?。s0.1 g，來源于常州市婦幼保健院），按脂肪組織總RNA提取試劑盒說明書提取分離總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測吸光度（A260 /280 nm），計算RNA濃度及純度。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應及PCR擴增取A260 /280 nm在1.8～2.0之間的標本，參照cDNA首鏈合成試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（-20℃保存）。所有PCR均在Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量PCR擴增儀上進行。反應結(jié)束后將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進行克隆測序，測序正確的重組質(zhì)粒用于制備標準品。

1.2.4VDR/GAPDH混合質(zhì)粒標準品制備測序結(jié)果比對正確的重組質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測濃度，選取1×106拷貝/μL數(shù)量級的VDR和GAPDH質(zhì)粒等比例混合作為標準品原液，將標準品原液10倍梯度稀釋成1×101～1×106拷貝/μL數(shù)量級的標準品，依次作為模板進行PCR擴增。

1.2.5雙重實時熒光定量PCR反應體系及條件優(yōu)化PCR總反應體系為25 μL，其中VDR/GAPDH混合質(zhì)粒4 μL，10× ImmoBuffer 2.5 μL，50 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，1 mmol/L ASETM熱啟動酶0.5 μL，100 μmol/L VDR及GAPDH正、反義引物和探針均為0.04 μL，加ddH2O補足至25 μL。反應條件為：95℃預變性10 min；95℃5 s，60℃15 s（溫度轉(zhuǎn)換率均為20℃/s），擴增40個循環(huán)；40℃1 min。60℃延伸時采集熒光信號。檢測通道分別為FAM通道（465～510 nm，VDR）和CY5通道（618～660 nm，GAPDH）。結(jié)果判斷：在陰性對照成立條件下，Ct值≤35 HU時，PCR擴增有效；Ct值≥40 HU時檢測結(jié)果為陰性；Ct值在35～40 HU時，建議復檢。

1.2.6雙重實時熒光定量PCR靈敏度和重復性試驗每個樣品重復5個批次（批間重復），每個批次重復5個復孔（批內(nèi)重復），根據(jù)臨界循環(huán)數(shù)以及模板起始拷貝數(shù)繪制標準曲線，計算標準方程。根據(jù)得到的Ct值計算其標準差和變異系數(shù)（CV），驗證該方法的批內(nèi)及批間重復性。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒序列分析PCR產(chǎn)物克隆測序比對結(jié)果見圖1，將VDR和GAPDH重組質(zhì)粒測序結(jié)果分別與其各自基因序列進行比對，結(jié)果顯示其符合率為100%。

2.2VDR/GAPDH擴增曲線及靈敏度分析VDR基因在FAM通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，見圖2A。GAPDH基因在CY5通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，見圖2B。VDR和GAPDH混合質(zhì)粒標準品經(jīng)10倍連續(xù)稀釋（4×101～4×105），按上述條件進行熒光定量RT-PCR，結(jié)果表明，該法對檢測人VDR和GAPDH基因靈敏度均為4×101拷貝/μL。

2.3標準曲線的建立及線性檢測范圍人VDR和GAPDH基因雙重實時熒光定量PCR標準曲線方程分別為：=-3.419 X+39.40（圖3A）、=-3.738 X+ 40.51（圖3B），其中Y代表Ct值，X代表模板量的對數(shù)值。其線性范圍為4×101～4×105拷貝/μL；決定系數(shù)R2分別為0.998、0.999；擴增效率E分別為96.10%、85.15%。

Tab. 1 Primer and probe sequences of VDR/GAPDH表1　VDR/GAPDH引物及探針序列

Fig.1 The analysis of recombinant plasmid sequence圖1　重組質(zhì)粒序列分析

Fig. 2 Amplification curves of human VDR/GAPDH detected by dual real-time fluorescence quantitative PCR assay圖2　雙重實時熒光定量PCR法檢測人VDR/GAPDH擴增曲線

2.4VDR/GAPDH標準品的重復性分析VDR和GAPDH批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.09%～1.21%、0.35%～ 0.88%，具有較好的批內(nèi)重復性，見表2。VDR和GAPDH批間變異系數(shù)分別為0.17%～0.51%、0.51%～ 2.46%，具有較好的批間重復性，見表3。

Fig.3 Standard curves of human VDR/GAPDH detected by dual real-time fluorescence quantitative PCR assay圖3　雙重實時熒光定量PCR法檢測人VDR/GAPDH的標準曲線

Tab. 2 Intra-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表2　VDR/GAPDH標準品的批內(nèi)重復性（n=5,±s）

Tab. 2 Intra-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表2　VDR/GAPDH標準品的批內(nèi)重復性（n=5,±s）

標準品4.0×1054.0×1044.0×1034.0×1024.0×101VDR±s(拷貝/μL) 19.16±0.08 22.53±0.07 25.97±0.07 29.29±0.03 32.66±0.40 CV(%) 0.43 0.31 0.26 0.09 1.21 18.75±0.16 23.33±0.21 27.41±0.15 31.83±0.11 35.24±0.16 GAPDH±s(拷貝/μL)　CV(%) 0.86 0.88 0.56 0.35 0.45

Tab. 3 Inter-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表3　VDR/GAPDH標準品的批間重復性（n=5,±s）

Tab. 3 Inter-batch repeatability of VDR/GAPDH standards表3　VDR/GAPDH標準品的批間重復性（n=5,±s）

標準品4.0×1054.0×1044.0×1034.0×1024.0×101VDR±s (拷貝/μL) 18.99±0.09 22.32±0.04 25.69±0.08 29.03±0.08 32.41±0.17 CV（%）0.48 0.17 0.31 0.27 0.51 18.66±0.09 23.04±0.57 26.95±0.55 31.27±0.77 34.63±0.56 GAPDH±s (拷貝/μL)　CV（%）0.51 2.46 2.03 2.45 1.61

3　討論

VDR具有調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的作用，并參與機體免疫和代謝調(diào)節(jié)[3]。VDR主要通過介導1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應。有文獻報道，1,25-(OH)2D3可誘導外周單核細胞分化成吞噬細胞，誘導單核細胞、巨噬細胞分化成破骨細胞，進而加快骨吸收[4]。VDR在免疫系統(tǒng)方面的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為能夠加強先天免疫[5]。此外，VDR還可以介導1,25-(OH)2D3抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞分化[6]。有研究報道，VDR基因敲除小鼠的耗氧量和產(chǎn)生CO2的量都顯著高于野生型小鼠[7]，此結(jié)果提示VDR可能與能量代謝有關。因此，檢測VDR mRNA的表達對深入研究其病理和生理功能及作用機制有非常重要的意義。

實時熒光定量PCR把擴增、分子雜交、酶動力學和光化學巧妙地結(jié)合在一起，克服了傳統(tǒng)PCR的缺點，使PCR處于全封閉條件下進行，并通過計算機實時動態(tài)檢測PCR產(chǎn)物，與傳統(tǒng)終末法PCR相比具有靈敏度高、特異性好和反應速度快等優(yōu)點[8]。但是，單熒光通道實時定量PCR方法檢測多種基因RNA表達水平，需配制多管體系（如靶基因和內(nèi)參基因），存在耗時長、費用高的缺點。

本研究結(jié)果顯示，VDR與GAPDH檢測靈敏度均較高，最低檢測限為101數(shù)量級，線性范圍廣，在1×101～1×105拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好線性，擴增效率高，批內(nèi)及批間重復性較好。

該方法實現(xiàn)了一次加樣同時檢測靶基因和內(nèi)參基因的目的，有效避免了兩次PCR間起始模板的加樣誤差，可以更精確地研究靶基因的相對表達水平。同時，該方法還有效克服了單熒光通道PCR的缺點，無需增加特殊試劑和材料，顯著簡化了實驗程序，縮短了檢測周期并降低了實驗費用，可以比較準確地測定人VDR基因的表達，具有高效、經(jīng)濟、穩(wěn)定和準確的優(yōu)勢，成為深入探討VDR病理和生理功能及作用機制有效的方法。

參考文獻

[1] Gonzalez-Parra E, Rojas-Rivera J, Tunon J, et al. Vitamin D recep?tor activation and cardiovascular disease [J]. Nephrol Dial Trans?plant, 2012, 27(Suppl 4):iv17-21. doi: 10.1093/ndt/gfs534.

[2] Gao L, Tao Y, Zhang L, et al. Vitamin D receptor genetic polymor?phisms and tuberculosis: updated systematic review and meta-anal?ysis [J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2010, 14 (1):15-23.

[3] Cui J, Chen H, Huang BR. The recent progress in the studies of vita?min D receptor [J]. Progress in Physiological Sciences, 2011, 42 (2): 95-99. [崔健,陳虹,黃秉仁.維生素D受體最新研究進展[J].生理科學進展, 2011, 42 (2):95-99].

[4] Pike JW, Lee SM, Meyer MB. Regulation of gene expression by 1, 25-dihydroxyvitamin D3 in bone cells: exploiting new approaches and defining new mechanisms [J]. Bonekey Rep, 2014, 3:482. doi: 10.1038/bonekey.2013.216. eCollection 2014.

[5] Ooi JH, Chen J, Cantorna MT. Vitamin D regulation of immune func?tion in the gut: why do T cells have vitamin D receptors [J]. Mol As?pects Med, 2012, 33 (1):77-82. doi: 10.1016/j.mam.2011.10.014.

[6] Gandini S, Gnagnarella P, Serrano D, et al. Vitamin D receptor poly?morphisms and cancer [J]. Adv Exp Med Biol, 2014, 810:69-105.

[7] Wong KE, Szeto FL, Zhang W, et al. Involvement of the vitamin D receptor in energy metabolism: regulation of uncoupling proteins[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009, 296 (4):E820- 828. doi: 10.1152/ajpendo.90763.2008.

[8] Aithal MG, Rajeswari N. Validation of housekeeping genes for gene expression analysis in glioblastoma using quantitative real- time polymerase chain reaction[J]. Brain Tumor Res Treat, 2015, 3(1): 24-29. doi: 10.14791/btrt.2015.3.1.24.

（2015-06-15收稿2015-08-27修回）（

本文編輯魏杰）

藥物臨床觀察

作者單位：蘇州大學附屬第三醫(yī)院綜合實驗室，常州市個性化診療高技術研究重點實驗室（郵編213003）

Establishing a method for detection of human vitamin D receptor using dual real-time fluorescence quantitative PCR

YU Miaomei，YU Yang，ZHANG Jun，YAO Shuang，PAN Lili，LUO Guanghua△
Comprehensive Laboratory，The Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou Key Lab of Individualized
Diagnosis and Treatment Associated with High Technology Research，Changzhou 213003，China
△Corresponding Author E-mail: shineroar@163.com

Abstract:Objective To establish a dual real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (dual realtime PCR) assay to detect human vitamin D receptor (VDR) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Methods GAPDH gene was used as the internal control. The specific primers and TaqMan probes were designed by Primer Premier 5.0 software, which were applied to detect the VDR/GAPDH mRNA levels. The obtained PCR products were puri?fied to construct the VDR/GAPDH recombinant plasmid, which was taken as the standard to analyze the sensitivity and re?peatability of the method. Results The amplification products were confirmed as the specific fragment of VDR/GAPDH by DNA sequencing instrument. The results showed that the sensitivity, linear range, the determinate coefficient, the amplifica?tion efficiency, the intra-assay and inter-assay coefficient of variation were 40 copies/μL, 4.00×101-4.00×105copies/μL, 0.998, 96.10%, 0.09%-1.21%, 0.17%-0.51% for VDR, and 40 copies/μL, 4.00×101-4.00×105copies/μL, 0.999, 85.15%, 0.35%-0.88%, 0.51%-2.46% for GAPDH, respectively. ConclusionThese results demonstrate that the dual real-time PCR assay with high sensitivity and specificity can detect the relative expressions of human VDR by single reaction tube, which can effectively shorten the time and reduce the experimental error.

Key words:receptors, calcitriol; polymerase chain reaction; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases; vitamin D receptor; dual real-time fluorescence quantitative PCR

中圖分類號：R331

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59072

作者簡介：喻妙梅（1987），女，碩士，主要從事臨床分子診斷方面研究