新一代生物燃料正丁醇的發(fā)展

楊俊杰 聞志強(qiáng) 楊晟 蔣宇

生物制造是以現(xiàn)代生物技術(shù)為基礎(chǔ)，大規(guī)模生產(chǎn)人類所需的化學(xué)品、藥品、能源和材料的一種新型工業(yè)模式，可以從源頭上解決資源短缺和環(huán)境污染問題。其中，正丁醇作為大宗化工原料或下一代生物燃料，是重要的工業(yè)生物制造的產(chǎn)品之一。

現(xiàn)代工業(yè)體系的發(fā)展是建立在對(duì)石油和煤炭等化石資源的開采和利用基礎(chǔ)之上的。化石資源需要漫長的地質(zhì)時(shí)期才能形成，不可再生，而且大規(guī)模使用化石資源還會(huì)增加溫室氣體排放?，F(xiàn)代生物技術(shù)的崛起，為人類的工業(yè)生產(chǎn)找到一條可持續(xù)發(fā)展的、綠色環(huán)保的道路。

正丁醇既是重要的大宗化工原料，又是繼乙醇后的一種極具發(fā)展前景的新一代液體燃料。利用生物制造技術(shù)生產(chǎn)的正丁醇是生物燃料和化工原料領(lǐng)域的代表性產(chǎn)品之一。通過產(chǎn)溶劑梭菌（Clostridia）的厭氧發(fā)酵，可將合適的碳水化合物轉(zhuǎn)化為丙酮（acetone）、正丁醇（n-butanol）和乙醇（ethanol）等溶劑，此類溶劑生產(chǎn)技術(shù)因而也被簡(jiǎn)稱為ABE發(fā)酵。

生物正丁醇制造的歷史和現(xiàn)狀

生物法制備正丁醇可追溯到第一次世界大戰(zhàn)期間，以產(chǎn)溶劑梭菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的正丁醇為起始原料合成丁二烯橡膠，是當(dāng)時(shí)生產(chǎn)合成橡膠的最理想路線。因此，在合成橡膠大規(guī)模生產(chǎn)的同時(shí)，以玉米粉等碳水化合物為底物的溶劑發(fā)酵得到快速發(fā)展，一度發(fā)展為僅次于酒精發(fā)酵的世界第二大發(fā)酵工業(yè)。但是，從1950年代開始，由于受到石油工業(yè)的沖擊，ABE發(fā)酵逐漸衰落，在歐洲、北美和日本等地逐步停止了生產(chǎn)。而中國，由于當(dāng)時(shí)特殊的經(jīng)濟(jì)和政治環(huán)境，成為少數(shù)幾個(gè)仍進(jìn)行ABE發(fā)酵生產(chǎn)的國家之一。1955年，中國第一家ABE發(fā)酵工廠——上海溶劑廠開始使用玉米發(fā)酵生產(chǎn)ABE。隨后的二三十年間，在北京、江蘇、天津、云南、山西、浙江、河北、山東、吉林等省市，又陸續(xù)建立了約30家規(guī)模在年產(chǎn)3000-10000噸的ABE發(fā)酵工廠，使得國內(nèi)ABE年生產(chǎn)能力達(dá)到17萬噸。然而，石油合成化工的蓬勃興起使得發(fā)酵法生產(chǎn)ABE在生產(chǎn)成本上越來越?jīng)]有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因此，國內(nèi)ABE發(fā)酵企業(yè)自1990年代開始逐步關(guān)閉。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著國際石油價(jià)格的劇烈波動(dòng)，以及基于石油資源不可再生性的共識(shí)，發(fā)酵法生產(chǎn)ABE技術(shù)重新引起廣泛關(guān)注。近幾年，多個(gè)廠家正丁醇生產(chǎn)線復(fù)產(chǎn)或者建成投產(chǎn)。年設(shè)計(jì)產(chǎn)量可達(dá)100萬噸規(guī)模。但2008年底的金融危機(jī)使得正丁醇價(jià)格從每噸1.3萬元下跌到5000元，迫使很多工廠停工或關(guān)閉。

目前，隨著油價(jià)逐步走低，石化法生產(chǎn)正丁醇的成本相應(yīng)下降。根據(jù)筆者掌握的中國正丁醇生產(chǎn)情況估算，目前石化法生產(chǎn)正丁醇的成本約為1.57美元/千克，而傳統(tǒng)ABE發(fā)酵正丁醇成本約為1.83美元/千克，因此石化法在成本上占優(yōu)勢(shì)。但是如果從用于正丁醇發(fā)酵的原料理論碳利用率（即理論上原料中碳原子以最佳的生物代謝過程轉(zhuǎn)化為正丁醇的比率）核算，生物法的理論原料成本遠(yuǎn)低于石化法的理論原料成本。因此，隨著技術(shù)發(fā)展和提高，通過降低過程成本，生物法的實(shí)際碳利用率會(huì)不斷提高，生物法有替代石化法的可能性。此外，生物法有可再生的優(yōu)勢(shì)，不會(huì)向生物圈的碳循環(huán)引入更多的碳。中國是少數(shù)幾個(gè)至今仍具備正丁醇發(fā)酵生產(chǎn)能力的國家之一。

正丁醇發(fā)酵的工藝

梭菌是產(chǎn)溶劑工業(yè)菌種的唯一來源，傳統(tǒng)ABE發(fā)酵中使用的工業(yè)菌種名目繁多，有關(guān)產(chǎn)溶劑梭菌的分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性研究比較混亂。近年來，通過系統(tǒng)學(xué)、基因組DNA/DNA雜交和DNA指紋圖譜，以及發(fā)酵性能等方面的比較研究和分析，一般認(rèn)為工業(yè)用產(chǎn)溶劑梭菌歸為4個(gè)種（species），所有原來的淀粉發(fā)酵型菌株隸屬于一個(gè)種，即丙酮正丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）。該菌呈現(xiàn)較強(qiáng)的淀粉酶活力，適用于發(fā)酵玉米和谷類等淀粉質(zhì)原料，同時(shí)具有獨(dú)特的系統(tǒng)發(fā)育特性。其他3個(gè)緊密相關(guān)的種，包括拜氏梭菌（C.beijerinckii）、糖丁酸梭菌（C.saccharobutylicum）和糖乙酸多正丁醇梭菌（C.saccharoperbutylacetonicum）與前者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

已鑒定的糖一發(fā)酵菌株大多數(shù)隸屬于拜氏梭菌。除南方少數(shù)企業(yè)外，針對(duì)我國以谷、薯類為主的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)狀況，溶劑發(fā)酵菌種多為丙酮正丁醇梭菌，且由國內(nèi)的研究所或工廠自行選育馴養(yǎng)而來，如中國科學(xué)院微生物研究所的AS l.70.上海溶劑廠的具抗噬菌體能力的新抗-2號(hào)。這些菌種所產(chǎn)溶劑中，3種組分（正丁醇、丙酮、乙醇）的比例均為6：3：1?！捌呶濉逼陂g，中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所的楊蘊(yùn)劉通過土樣分離和誘變篩選獲得到了高正丁醇比例的菌株EA 2018，其溶劑中3種組分的比例達(dá)到7：2：1，淀粉轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)菌種高5%。此外，其他溶劑廠也結(jié)合自身特點(diǎn)，選育出適用于特定原料如糖蜜、水解液的菌種。

傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)正丁醇的工藝主要包括溶劑的連續(xù)發(fā)酵、產(chǎn)物和副產(chǎn)物的蒸餾法分離提取、生產(chǎn)過程中的環(huán)境保護(hù)措施等。

20世紀(jì)四五十年代，工業(yè)生產(chǎn)中生物正丁醇發(fā)酵使用的是大容積的批式發(fā)酵罐（20萬-80萬升）。主要發(fā)酵基質(zhì)是玉米粉或糖蜜，每批發(fā)酵進(jìn)行40-50小時(shí)。這種發(fā)酵方式相對(duì)簡(jiǎn)單，但生產(chǎn)效率低，操作麻煩，勞動(dòng)強(qiáng)度大，清洗消毒的物質(zhì)和能量消耗也大。20世紀(jì)五六十年代開始逐步實(shí)施連續(xù)發(fā)酵工藝，目前國內(nèi)大規(guī)模正丁醇生產(chǎn)采用連續(xù)發(fā)酵工藝。連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)率通常是批式發(fā)酵的2-3倍。減少了清洗消毒操作，還減少了物質(zhì)和能量消耗及廢水排放。

產(chǎn)物提取是正丁醇發(fā)酵中能量消耗較大的環(huán)節(jié)。發(fā)酵液中正丁醇含量一般僅2%左右。工業(yè)生產(chǎn)一般采用連續(xù)蒸餾的方法。通入蒸汽，利用正丁醇和丙酮、乙醇、水等組分凝沸點(diǎn)的差異，通過一系列蒸餾塔裝置，將各組分分餾出來。而后通過精餾使產(chǎn)品進(jìn)一步純化。隨著社會(huì)環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，減少三廢排放已成為正丁醇工藝研究的一個(gè)重要方向。

生物正丁醇制造面臨的挑戰(zhàn)

從傳統(tǒng)生物正丁醇生產(chǎn)成本構(gòu)成看，原料和蒸汽成本分別占75%和16%。生物正丁醇生產(chǎn)中與這兩項(xiàng)成本相關(guān)的可改進(jìn)的方面是：用作發(fā)酵的碳源成本偏高和政策限制；發(fā)酵過程中的正丁醇選擇性較低；發(fā)酵液中的正丁醇效價(jià)（即單位純品質(zhì)量所含的有效成分）低。

獲取廉價(jià)發(fā)酵原料是所有生物基產(chǎn)品的共性問題

在正丁醇生產(chǎn)中，由于原料成本占總成本的3/4左右，因此原料問題對(duì)于降低生產(chǎn)成本尤為重要。近年來由于國內(nèi)以玉米等糧食作物為原料的生物煉制行業(yè)發(fā)展迅速，一定程度上促成全國糧食價(jià)格較快上升，致使生物正丁醇生產(chǎn)成本大幅度增加。同時(shí)，國家出于維護(hù)糧價(jià)穩(wěn)定和糧食安全戰(zhàn)略的考慮，開始限制大規(guī)模使用玉米等糧食作物來發(fā)展生物能源。因此，如何通過提高原料轉(zhuǎn)化率和利用廉價(jià)非糧類原料生產(chǎn)正丁醇、降低生產(chǎn)成本，成為該產(chǎn)業(yè)必須直面的瓶頸問題。

選擇同型正丁醇發(fā)酵提高正丁醇發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性

傳統(tǒng)ABE發(fā)酵生成的是三聯(lián)產(chǎn)物：丙酮、正丁醇和乙醇，還有少量有機(jī)酸。這使正丁醇占總?cè)軇ū?、正丁醇、乙醇）的質(zhì)量比為60%-70%，增加了后續(xù)產(chǎn)品分離設(shè)備的投入及能耗；且正丁醇對(duì)原料（以葡萄糖計(jì)算）的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為25%-29%，僅為理論值的61%-71%。如果采用同型正丁醇發(fā)酵，可提高原料利用率、降低原料成本，且不受三種產(chǎn)品市場(chǎng)供求差異的影響。

提高發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇的濃度

傳統(tǒng)ABE發(fā)酵工藝中，正丁醇濃度不到2%，導(dǎo)致蒸餾成本約占生物正丁醇生產(chǎn)總成本的20%。如果將正丁醇發(fā)酵產(chǎn)物的濃度由12克/升提高到19克/升，產(chǎn)物分離的后續(xù)蒸餾成本可降低一半。然而，傳統(tǒng)丙酮正丁醇梭菌發(fā)酵生產(chǎn)中的正丁醇終濃度維持在13-14克/升，難于超過這一閾值的原因在于所生成的產(chǎn)物是溶劑。其中特別是因?yàn)檎〈紝?duì)產(chǎn)溶劑梭菌細(xì)胞的毒害作用。提高產(chǎn)溶劑梭菌的耐受性或在高耐受正丁醇的宿主中重構(gòu)產(chǎn)正丁醇途徑，有望實(shí)現(xiàn)高濃度正丁醇發(fā)酵。

針對(duì)挑戰(zhàn)的探索

原料的開發(fā)

（1）非糧作物。非糧作物包括薯類、菊芋、甜高粱等。薯類是淀粉含量很高的農(nóng)作物，包括木薯、紅薯、馬鈴薯等，在我國和世界各地均有大量種植。薯類原料的價(jià)格較玉米、小麥等糧食類原料低廉，因此已被大量用于生物乙醇的生產(chǎn)。一些生物正丁醇生產(chǎn)企業(yè)也在玉米原料中混入薯類原料進(jìn)行發(fā)酵，以減少玉米用量。菊芋是一種多年生草本植物（俗稱洋姜、鬼子姜），生物量極大，每公頃可產(chǎn)菊芋塊莖30-75噸。鮮菊芋塊莖中富含多聚果糖，是一種極具開發(fā)潛力的半野生資源，是微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學(xué)品的良好糖源。國外以菊芋為原料發(fā)酵制備正丁醇的研究較多。甜高粱是普通粒用高粱的一個(gè)變種，具有抗旱、耐澇、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)、生物量高、糖分高等特點(diǎn)，是名副其實(shí)的高效能植物。用不適宜糧食作物生產(chǎn)的邊際性土地種植甜高梁，將甜高梁稈榨汁，利用其中糖分發(fā)酵生產(chǎn)燃料，是另外一條思路。上述非糧作物能一定程度上緩解生物正丁醇的高成本，但其成本還是太高。

（2）木質(zhì)纖維素。木質(zhì)纖維素被普遍認(rèn)為是一種最具應(yīng)用潛力的發(fā)酵原料。近年來，國外圍繞木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備ABE溶劑的研究多有報(bào)道。目前的主流工藝是：原料預(yù)處理和水解為單糖，糖液發(fā)酵生成正丁醇，產(chǎn)物蒸餾回收等。盡管工藝路線具可行性，但仍有諸多技術(shù)瓶頸需要克服。僅就菌種而言，纖維水解液中五碳糖和六碳糖的同等利用是迫切需要解決的難點(diǎn)之一。另外，纖維素水解時(shí)需添加大量纖維素酶，這也將大幅增加生產(chǎn)成本。

利用纖維素直接生產(chǎn)正丁醇是更理想的工藝，但是產(chǎn)溶劑梭菌不具備纖維素降解能力。將纖維素降解菌，如嗜纖維梭菌（C.cellulovorans），和產(chǎn)溶劑梭菌，如拜氏梭菌（C.beijerinckii），混菌培養(yǎng)，使兩種菌各司其職、互利共生，可實(shí)現(xiàn)纖維素正丁醇的“一鍋法”生產(chǎn)，免去纖維素酶生產(chǎn)和添加過程。不過，共生系統(tǒng)的調(diào)控過程比較復(fù)雜，需兼顧體系內(nèi)各微生物種群的生長及代謝特點(diǎn)，維持系統(tǒng)穩(wěn)定和調(diào)控以及優(yōu)化系統(tǒng)均較為困難。一旦混菌系統(tǒng)中種群比例失衡，會(huì)使得營養(yǎng)組分?jǐn)z取競(jìng)爭(zhēng)加劇，或者外界條件偏利于某階段的非“優(yōu)先”種群，互利或偏利關(guān)系將會(huì)大大削弱甚至導(dǎo)致共生系統(tǒng)崩潰。為實(shí)現(xiàn)混菌體系的高效性、穩(wěn)定性和可控性，需針對(duì)混菌體系的設(shè)計(jì)與構(gòu)建原理，以及高效混菌體系的物質(zhì)流、能量流、信息流的適配與調(diào)控機(jī)制開展研究，利用用合成生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)纖維素正丁醇的高產(chǎn)。

（3）合成氣。合成氣主要是由CO、H₂、C0₂組成的混合氣體，來源廣泛，包括煤、油頁巖、焦油沙、重殘?jiān)⒘淤|(zhì)天然氣以及生物質(zhì)。以合成氣為原料合成氨、含氧化合物和烴類等化工原料的生產(chǎn)技術(shù)已投入商業(yè)運(yùn)行。近年來，以生物技術(shù)主導(dǎo)的合成氣綜合利用技術(shù)引起廣泛關(guān)注，尤其是通過厭氧發(fā)酵方法將合成氣轉(zhuǎn)化成各種有用的燃料和化學(xué)品已成為新的研究熱點(diǎn)。

微生物利用鋼廠尾氣厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的技術(shù)接近商業(yè)化。永達(dá)爾梭菌（C.ljungdahlii）是目前合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇最具潛力的菌株。乙醇發(fā)酵的產(chǎn)物濃度上升到23克/升。

而目前已知的可利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的微生物菌株僅有C.carboxidivorans P7（DSM15243）和Butyribacterium methylotrophicum（DSM3468），正丁醇產(chǎn)量分別為1.776克/升和2.7克/升。為實(shí)現(xiàn)合成氣生產(chǎn)正丁醇的產(chǎn)業(yè)化，后續(xù)研究中可通過以下方式實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提升：在C.ljungdahlii等乙醇生產(chǎn)菌株中引入乙醇到正丁醇的代謝途徑；對(duì)天然的可利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的微生物進(jìn)行代謝工程改造，提高正丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度；在傳統(tǒng)的利用糖源的正丁醇生產(chǎn)菌株中導(dǎo)入合成氣代謝途徑。

提高正丁醇比例

提高正丁醇比例可通過對(duì)微生物正丁醇途徑的重構(gòu)和優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)。經(jīng)典的正丁醇代謝途徑來源于產(chǎn)溶劑梭菌。產(chǎn)溶劑梭菌除生成60%-70%的正丁醇外，還有20%-30%的丙酮和10%的乙醇兩種低值副產(chǎn)物。通過對(duì)正丁醇途徑的重構(gòu)和優(yōu)化有可能降低丙酮和乙醇的合成量，在保持菌株原有較高轉(zhuǎn)化效率的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高正丁醇在總?cè)軇┲兴嫉谋壤?/p>

近十年來，采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，利用基因工程和代謝工程技術(shù)改造正丁醇發(fā)酵菌種（包括基因敲除、基因表達(dá)和應(yīng)用反義RNA進(jìn)行基因調(diào)控等）以及通過解除代謝過程中可能存在的產(chǎn)物和中間產(chǎn)物抑制，強(qiáng)化正丁醇生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，切斷或者弱化丙酮、乙醇等副產(chǎn)物生成的代謝途徑，提高了正丁醇在溶劑中的比例。

提高正丁醇濃度

正丁醇對(duì)菌體細(xì)胞具有較大毒性，通過菌株遺傳改造增強(qiáng)其正丁醇耐受性，為提高正丁醇生物合成的選擇性和產(chǎn)物濃度創(chuàng)造了有利條件。為降低發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇對(duì)生產(chǎn)菌種的抑制作用，尚可通過發(fā)酵和改進(jìn)下游工藝，來減輕發(fā)酵液中的正丁醇毒性，進(jìn)而提高發(fā)酵終點(diǎn)的正丁醇濃度。另一思路是，在高耐正丁醇菌株中構(gòu)建異源正丁醇途徑。

傳統(tǒng)正丁醇發(fā)酵中，產(chǎn)物濃度提高主要受制于菌株正丁醇耐受性差。主要的產(chǎn)溶劑梭菌C.acetobutylicum的正丁醇耐受極限低于2%（體積比）。從菌體細(xì)胞對(duì)正丁醇耐受性的研究結(jié)果來看，該表型是由多基因決定的，并且擁有十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這使得對(duì)目前菌株的正丁醇耐受性改造存在一定困難。研究發(fā)現(xiàn)，某些菌株如Lactob ac illLLs6rev is、Lactobacillus delbrueckii具有明顯高于目前產(chǎn)溶劑梭菌的正丁醇耐受性，表明高正丁醇耐受性的菌株在自然界中是存在的。研究者通過馴化和篩選等策略，獲得2株正丁醇耐受菌株，經(jīng)鑒定均屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)一個(gè)乳酸菌庫的正丁醇耐受性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中大部分菌株具有明顯高于產(chǎn)溶劑梭菌的正丁醇耐受性，這暗示乳酸桿菌屬作為一個(gè)整體，可能具有較高正丁醇耐受性。同時(shí)，獲得數(shù)株正丁醇耐受極限高于3%（體積比）的菌株，有潛力成為構(gòu)建正丁醇途徑的宿主菌。

展望

正丁醇目前的石化法較之生物法在成本上占優(yōu)。生物法原料理論成本遠(yuǎn)低于石化法原料理論成本。隨著各項(xiàng)技術(shù)不斷提高，生物法有替代石化法的可能性。此外，生物法還具備碳中性的優(yōu)勢(shì)。中國是少數(shù)幾個(gè)至今仍具備正丁醇發(fā)酵生產(chǎn)能力的國家之一。目前纖維素正丁醇是目前唯一正在商業(yè)化進(jìn)程中的路線，其經(jīng)濟(jì)效益有待市場(chǎng)考證。進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)性則有待其他各項(xiàng)技術(shù)的共同進(jìn)步，以及國家政策的鼓勵(lì)。以鋼廠尾氣制備正丁醇是有望獲得最大經(jīng)濟(jì)性的技術(shù)路線，但要獲得可商業(yè)化的菌種尚有諸多挑戰(zhàn)。