DNA修復(fù)機(jī)制的研究

劉揚(yáng) 杭海英

2015年度的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎和諾貝爾化學(xué)獎分別授予了研究DNA損傷響應(yīng)和DNA修復(fù)機(jī)制的科學(xué)家，以表彰他們在基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域所取得的成就。

1953年，沃森（J.Watson）和克里克（F.Crick）解析出著名的DNA（脫氧核糖核酸）分子雙螺旋結(jié)構(gòu)。從那時起，DNA分子有遺傳屬性并在細(xì)胞分裂時能夠自我復(fù)制，從而保持物種的延續(xù)就成為大家的共識。但是DNA一直受到多種外源（如紫外線照射和環(huán)境污染物等）及內(nèi)源（如活性自由基）物質(zhì)的攻擊，同時DNA的每次復(fù)制進(jìn)程都伴隨著隨機(jī)錯誤。所有這些因素可導(dǎo)致DNA發(fā)生氧化、烷基化、形成多種DNA加合物，以及DNA單鏈或雙鏈的斷裂。但是DNA分子并沒有因此變得雜亂無章，依然能正常穩(wěn)定地工作。這種神奇工程的締造者就是生物體內(nèi)那些被稱為“DNA管家”的蛋白分子，是它們對基因組不斷進(jìn)行監(jiān)督并及時校正修復(fù)DNA的損傷，從而使生物體維持正常的新陳代謝。

2015年度拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎（Albert Lasker Award for Basic Medical Research）分別授予兩位研究DNA損傷修復(fù)的科學(xué)家，威特金（E.M.Witkin）和埃利奇（S.J.Elledge），以表彰他們在DNA損傷響應(yīng)一保護(hù)基因組機(jī)制方面的發(fā)現(xiàn)。2015年度諾貝爾化學(xué)獎也授予了研究DNA損傷修復(fù)的科學(xué)家，他們是英國的林達(dá)爾（T.Lindahl），美國的莫德里奇（P.Modrich）和桑賈爾（A.Sancar），他們的貢獻(xiàn)在于闡釋了細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)的機(jī)制和對遺傳信息的保護(hù)。同年的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎和諾貝爾獎都授予同一研究領(lǐng)域的科學(xué)家，是過去沒有發(fā)生過的事情，這表明了DNA損傷修復(fù)的基礎(chǔ)性研究工作在科學(xué)發(fā)展、人類健康方面所取得的成績和對未來攻克癌癥、造福人類的重要意義。

堿基切除修復(fù)

林達(dá)爾是三位諾獎得主中，最早對DNA穩(wěn)定性提出質(zhì)疑的科學(xué)家。林達(dá)爾1938年出生于瑞典斯德哥爾摩，獲瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院（Karolinska Institute）醫(yī)學(xué)博士學(xué)位。1981年-2009年任劍橋大學(xué)克萊爾實(shí)驗(yàn)室（Clare Hall Laboratory）主任。2010年至今，任弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）名譽(yù)負(fù)責(zé)人。早在1960年代末，他就發(fā)現(xiàn)作為一種與DNA相近的分子，RNA（核糖核酸）的降解要快得多，高溫時更是如此?！半y道DNA就真的那么穩(wěn)定嗎？”帶著這個疑問，林達(dá)爾開始了對DNA穩(wěn)定性的研究，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA經(jīng)歷著緩慢但卻可見的衰變。正是由于體內(nèi)DNA損傷修復(fù)機(jī)制的存在，使得每天都會遭遇成千上萬次攻擊的基因組仍能保持正常的運(yùn)行。從此，林達(dá)爾打開了通向DNA損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的大門。

他首先從尋找細(xì)菌中的修復(fù)蛋白著手。胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）與鳥嘌呤（G）組成DNA的四種堿基，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，T與A在兩個氫鍵的作用下配對出現(xiàn)，而C和G則在三個氫鍵的作用下配對出現(xiàn)。但是，研究發(fā)現(xiàn)C很容易失去環(huán)外氨基，失去氨基的C（即T）便與A在兩個氫鍵的作用下配對，導(dǎo)致基因信息的改變。這種缺陷的持續(xù)將會導(dǎo)致DNA復(fù)制發(fā)生變異，從而誘發(fā)基因組的不穩(wěn)定性。

1974年，林達(dá)爾首先報(bào)道了一種細(xì)菌酶，這種細(xì)菌酶能夠移除受損的C，從而抵消產(chǎn)生的突變。隨后，他發(fā)現(xiàn)并檢測了細(xì)胞中多種用來進(jìn)行DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)。糖基化酶（glycosylases）是這些修復(fù)蛋白中執(zhí)行堿基切除修復(fù)過程中的第一步（即切除各種受損堿基）的一類水解酶。隨后，他的研究團(tuán)隊(duì)又揭示了該通路中堿基切除后的幾個配套修復(fù)步驟，描繪出了“堿基切除修復(fù)”（BER）機(jī)制的全貌，表明堿基切除修復(fù)不僅存在于細(xì)菌中，也發(fā)生在人和其他生物上面。

1996年，林達(dá)爾成功地在生物體外實(shí)驗(yàn)中重組各種人堿基修復(fù)蛋白因子，證明人細(xì)胞也存在堿基切除修復(fù)機(jī)制。林達(dá)爾的工作表明DNA修復(fù)領(lǐng)域是多因子參與的修復(fù)通路。由于堿基損傷在細(xì)胞內(nèi)頻繁發(fā)生.該機(jī)理的揭示對于研究其他修復(fù)通路機(jī)理有至關(guān)重要的啟迪作用。

DNA錯配修復(fù)

莫德里奇1946年出生于美國新墨西哥州，在斯坦福大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，是美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心生物化學(xué)教授，也是霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所（Howard Huges Medical Institute）的研究員。莫德里奇與DNA世界的結(jié)緣來自于他的父親——一位高中生物學(xué)教師的影響，作為一位生物學(xué)老師，父親對DNA相關(guān)內(nèi)容有著濃厚的興趣，并潛移默化地影響了兒子的研究方向。

從博士研究生到助理教授，莫德里奇檢驗(yàn)了一系列作用于DNA的酶：DNA聚合酶，DNA連接酶，以及多種限制性內(nèi)切酶等。在1970年代末，他把Dam甲基化酶作為他主要的研究方向。1979年，他報(bào)道了Dam甲基化酶可以將甲基基團(tuán)加合到DNA上，這些甲基基團(tuán)扮演著路標(biāo)的角色，指示特定的限制性內(nèi)切酶在正確位置切斷DNA鏈。此后，哈佛大學(xué)的分子生物學(xué)家梅塞爾森（M.Meselson）發(fā)現(xiàn)，甲基基團(tuán)的指示功能還體現(xiàn)于：當(dāng)DNA出現(xiàn)錯配堿基時，甲基基團(tuán)可以幫助細(xì)胞確認(rèn)在糾錯時的正確DNA模板。隨后他們通過共同研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA出現(xiàn)堿基錯配時，會不斷糾正沒有甲基化的那條鏈。由此，DNA錯配修復(fù)是DNA發(fā)生復(fù)制時一種自然的過程，在DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)錯誤、互補(bǔ)鏈上堿基不能匹配時，DNA錯配修復(fù)功能發(fā)揮作用，以未甲基化為標(biāo)志來識別新合成的錯誤的DNA鏈，糾正不匹配的堿基。

事實(shí)上，在莫德里奇開始研究DNA錯配修復(fù)機(jī)制之前，科學(xué)家就已知道DNA在復(fù)制進(jìn)程中會發(fā)生錯誤，體現(xiàn)于：A與C或G與T發(fā)生錯配。莫德里奇的工作表明，DNA錯配修復(fù)機(jī)制主要用來修復(fù)DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的堿基錯配，這種機(jī)制的存在可使產(chǎn)生的堿基錯配率降低三個數(shù)量級。對莫德里奇來說，這一發(fā)現(xiàn)開啟了他之后十余年的系統(tǒng)性研究，他的實(shí)驗(yàn)室也相繼研究并鑒定出11個參與DNA錯配修復(fù)的蛋白因子，并成功地在體外實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)了復(fù)雜的錯配修復(fù)分子的修復(fù)過程，此成果發(fā)表在1989年的美國《科學(xué)》（Science）周刊上?！拔覍茖W(xué)研究的熱愛就在于它能解決問題的一面”，莫德里奇在回憶當(dāng)年研究并表征不同DNA錯配修復(fù)蛋白的經(jīng)歷時說，“我從其中每一小步過程中都體會到解決問題后的快樂與滿足”。

核苷酸切除修復(fù)

桑賈爾1946年出生于土耳其，擁有土耳其、美國雙重國籍，美國德州大學(xué)達(dá)拉斯分校博士畢業(yè)，現(xiàn)任美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校生物化學(xué)與生物物理教授。興趣是人們最好的老師，桑賈爾的經(jīng)歷對這句話做出了最好的說明。桑賈爾有7個兄弟姐妹，家境一般，但他父母仍盡最大努力讓每個孩子都接受教育。桑賈爾上學(xué)時非常用功，對生命科學(xué)，尤其是生物化學(xué)特別感興趣，因而攻讀生化博士。對桑賈爾來說，成為一名生物學(xué)家是他的理想，但是他的生化教授卻建議他先去學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)，做一名醫(yī)生，然后再回來做基礎(chǔ)研究。他聽從老師的建議，在行醫(yī)兩年后關(guān)閉了自己的診所，去美國攻讀博士學(xué)位。

在科研生涯的早期，桑賈爾就發(fā)現(xiàn)，即使細(xì)菌暴露在紫外線輻射下奄奄一息，可當(dāng)它們再受到可見藍(lán)光的照射時，卻可以很快恢復(fù)狀態(tài)。究竟是什么原因使得細(xì)菌死里逃生？懷著對這一神奇現(xiàn)象的好奇心，他發(fā)現(xiàn)了可以修復(fù)紫外損傷DNA的酶——光解酶，并利用DNA重組技術(shù)使細(xì)菌產(chǎn)生出足夠的光解酶。然而這一研究結(jié)果在當(dāng)時并沒有引起重視。博士畢業(yè)后，他想繼續(xù)在DNA損傷修復(fù)領(lǐng)域進(jìn)行研究，可是所發(fā)出的全部博士后申請都被拒絕。后來，他了解到耶魯大學(xué)的魯珀（D.Rupp）對DNA修復(fù)很感興趣，雖然當(dāng)時魯珀的實(shí)驗(yàn)室沒有博士后的位置，但卻有實(shí)驗(yàn)員的空缺，于是他以實(shí)驗(yàn)員的名義加入了魯珀實(shí)驗(yàn)室。當(dāng)時，耶魯大學(xué)是美國研究DNA損傷修復(fù)的重要中心，除了魯珀外，還有很多該領(lǐng)域最前沿的科學(xué)家，如在切除修復(fù)和重組修復(fù)中做出杰出貢獻(xiàn)的霍華德一弗蘭德斯（P.Howard-Flanders）、哈欽森（F.Hutchinson）和雷?。–.Radding）都在那里工作過。

當(dāng)時，科學(xué)家已經(jīng)知道細(xì)菌有兩種修復(fù)紫外線損傷DNA的機(jī)制：一種依賴于光解酶；另一種是形成對紫外線敏感的細(xì)菌突變系，它們又分別稱為UvrA、UvrB與UvrC的突變基因。于是，桑賈爾便開始在耶魯大學(xué)探索紫外修復(fù)系統(tǒng)的分子機(jī)制，成功分離并純化出了在這種系統(tǒng)中起作用的UvrA、UvrB和UvrC蛋白。

他首次發(fā)現(xiàn)這三種蛋白的協(xié)同作用可以識別紫外輻射造成的DNA損傷。其中UvrA和UvrB的主要作用是對損傷進(jìn)行識別與確認(rèn)，而UvrC的功能是在DNA受損部位兩端進(jìn)行剪切，這樣一個包含損傷部位在內(nèi)的12-13個核苷酸片段就被移除。隨后，DNA聚合酶以完好的DNA鏈為模板，合成正常的DNA序列用以彌補(bǔ)空缺，以便DNA連接酶將新合成的片段與原DNA鏈相連。最終，細(xì)菌的“核苷酸切除修復(fù)”機(jī)制就這樣誕生了。此后，桑賈爾對人體內(nèi)的“核苷酸切除修復(fù)”機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人體中有更多的蛋白分子參與紫外線損傷修復(fù)，其修復(fù)機(jī)制遠(yuǎn)比在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的要復(fù)雜得多，但基本原理是類似的，都包括對損傷的識別、確認(rèn)和切除。

DNA損傷應(yīng)答

損傷后的DNA不僅要有DNA修復(fù)，還需要DNA損傷響應(yīng)機(jī)制來共同參與錯誤的糾正，從而保證正常生理活動和生命延續(xù)。2015年拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎獲得者威特金首先發(fā)現(xiàn)這一損傷響應(yīng)機(jī)制的存在，并闡述了其在原核生物中的基本特征，而另一獲獎?wù)甙＠鎰t揭示了在真核生物中DNA損傷響應(yīng)的分子通路。這兩套系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)細(xì)節(jié)各異，但在調(diào)控大量基因的活性以幫助機(jī)體免遭厄運(yùn)的功能方面則是一致的。

威特金1921年出生于紐約，1971年開始任新澤西州拉特格斯大學(xué)（Rutgers University）教授，直到1991年退休。1944年她首先發(fā)現(xiàn)具有抗紫外線能力的大腸桿菌，并發(fā)現(xiàn)抗紫外線特征的可遺傳性，開啟了細(xì)菌紫外線損傷修復(fù)的遺傳學(xué)研究。后來，越來越多的證據(jù)證明，DNA是遺傳物質(zhì)和基因載體，威特金的研究則逐漸聚焦到大腸桿菌DNA損傷響應(yīng)。她發(fā)現(xiàn)細(xì)菌病毒（即噬菌體）的釋放、易錯類型的DNA復(fù)制、細(xì)菌生長及分裂等DNA損傷響應(yīng)具有許多共同的特征，這些研究為后來提出的細(xì)菌DNA損傷應(yīng)急機(jī)制（SOS機(jī)制）奠定了基礎(chǔ)。

現(xiàn)在知道，SOS系統(tǒng)包括40多個基因，其中關(guān)鍵蛋白是RecA。當(dāng)DNA受到損傷并衍生出單鏈DNA時，RecA以多聚鏈狀方式（RecA*）結(jié)合到單鏈DNA上，從而破壞抑制蛋白Lex A。Lex A分解后，細(xì)菌細(xì)胞SOS應(yīng)答就啟動了。RecA*還可切除噬菌體基因阻遏蛋白，也可直接或間接切斷UmuD形成UmuD，進(jìn)而促進(jìn)易錯重組的修復(fù)。

相比前四位科學(xué)家，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院布里格姆婦女醫(yī)院（Brigham and Women's Hospital）的埃利奇教授最為年輕。他在1990年代進(jìn)入DNA修復(fù)領(lǐng)域時，也用大腸桿菌研究DNA重組修復(fù)，發(fā)現(xiàn)了Rad53激酶在協(xié)調(diào)DNA修復(fù)中的重要作用。后來，他的實(shí)驗(yàn)室將研究方向轉(zhuǎn)到真核生物DNA損傷響應(yīng)和修復(fù)，并找到1000多個參與真核生物損傷響應(yīng)的蛋白。在真核生物細(xì)胞中，RPA蛋白結(jié)合損傷產(chǎn)生單鏈DNA，活化激酶ATR。而ATM激酶的活化對應(yīng)著損傷誘發(fā)的雙鏈DNA斷裂。ATR和ATM隨后會激活一連串其他激酶，包括Chkl、Chk2等，這些激酶又會作用于多種下游目標(biāo)，啟動多種損傷應(yīng)答，如細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老等。

DNA修復(fù)研究展望

DNA修復(fù)系統(tǒng)的缺陷會對正常人細(xì)胞造成重大威脅，并引發(fā)癌癥等疾病。如核苷酸切除修復(fù)基因有缺陷的人，在陽光下就容易患上皮膚癌；缺失DNA錯配修復(fù)基因的人，會更容易患上結(jié)腸癌。但是，對于癌細(xì)胞的DNA來說，通過抑制修復(fù)體系，就能增加化療療效，減緩癌癥的生長。比如，奧拉帕尼（olaparib）就是一種可抑制修復(fù)體系的抗癌藥物。所以，在對癌癥治療的同時，如何更好地開展癌癥預(yù)防也同樣重要。通過基因測序及樣本驗(yàn)證，鑒定得到有效的癌癥驅(qū)動基因，可以更精準(zhǔn)地對不同患者進(jìn)行相關(guān)的預(yù)防治療。

事實(shí)上，不僅僅是上述科學(xué)家，包括中國科學(xué)家在內(nèi)的許多科學(xué)家，都對闡釋DNA修復(fù)通路做出了杰出的工作。到目前為止，國內(nèi)的DNA損傷修復(fù)研究領(lǐng)域已獲得多項(xiàng)國家科技部重大研究計(jì)劃項(xiàng)目的資助。此外，許多修復(fù)通路在細(xì)胞內(nèi)也有重疊，還與其他生物過程、途徑相互交叉，它們之間的協(xié)調(diào)機(jī)理還需要做進(jìn)一步的研究突破。相信通過國內(nèi)外科學(xué)家對DNA損傷修復(fù)領(lǐng)域及其他相關(guān)領(lǐng)域更多的探索和研究，攻克癌癥、早衰、糖尿病等一系列頑疾的目標(biāo)會離我們越來越近。