花葉良姜離體再生體系的建立

林茂 李進(jìn)華 唐遒冥 龔建英 蔣濟(jì)剛 鐘程 王華新

摘要：【目的】建立花葉良姜高頻高效離體再生體系，為其種苗周年規(guī)?；a(chǎn)提供新方法?！痉椒ā恳曰ㄈ~良姜種子為材料，開(kāi)展無(wú)菌萌發(fā)、愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化及生根培養(yǎng)研究。【結(jié)果】花葉良姜種子依次經(jīng)75%乙醇處理60 s、0.1%升汞處理10 min、5%次氯酸鈉處理3 min，污染率僅5.00%，萌發(fā)率為75.83%；適宜花葉良姜愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+1.50 mg/L 6-BA+0.30 mg/L 2，4-D，適宜花葉良姜愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+2.00 mg/L TDZ+

0.10 mg/L 2，4-D，分化系數(shù)達(dá)10.03；花葉良姜組培苗最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.00 mg/L ABT1號(hào)生根粉，生根率為98.00%?！窘Y(jié)論】通過(guò)愈傷組織途徑可建立花葉良姜的離體再生體系。

關(guān)鍵詞： 花葉良姜；愈傷組織；無(wú)菌萌發(fā)；再生體系

中圖分類號(hào)： Q949.71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）11-1909-05

Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish high-efficiency and high-frequency in vitro regeneration system of Alpinia zerumbet Variegata，in order to provide a new method for annual large-scale production of A. zerumbet seedling. 【Method】Using A. zerumbet seeds as materials，the experiment on aseptic budding，callus induction，callus differentiation and rooting was carried out. 【Result】Results showed that， after A. zerumbet seeds were disinfected with 75% ethanol for 60 s，then 0.1% mercury chloride for 10 min，finally 5% sodium hypochlorite for 3 min，contamination rate was only 5.00%，and germination rate was 75.83%. Suitable medium for inducing callus was MS+1.50 mg/L 6-BA+0.30 mg/L 2，4-D，suitable medium for callus differentiation was MS+2.00 mg/L TDZ+0.10 mg/L 2，4-D，differentiation coefficient was up to 10.03. Furthermore，optimum medium for rooting was 1/2MS+1.00 mg/L ABT1 rooting powder，rooting rate was 98.00%.【Conclusion】In vitro regeneration system of A. zerumbet can be established by the way of callus culture.

Key words： Alpinia zerumbet Variegata； callus； aseptic budding； regeneration system

0 引言

【研究意義】花葉良姜（Alpinia zerumbet Variegata）為姜科山姜屬多年生草本植物，別名花葉艷山姜、彩葉姜、斑紋月桃，原產(chǎn)于東亞，在我國(guó)福建、廣東及臺(tái)灣等地也有栽培（秦麗鳳等，2013）?；ㄈ~良姜葉色艷麗，花姿優(yōu)美，花香清純，觀賞價(jià)值極高，是園林綠化工程不可或缺的素材，在園林造景中的應(yīng)用頻率越來(lái)越高，市場(chǎng)需求越來(lái)越大。然而傳統(tǒng)的塊莖分株繁殖存在增殖系數(shù)低、繁殖速度慢等問(wèn)題（郝靜韋，1996；曾宋君，2001；趙秀芳，2004；林瓞文，2006），無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。組培快繁技術(shù)具有繁殖速度快、系數(shù)高、后代整齊一致的優(yōu)點(diǎn)，是種苗高效繁殖的有效途徑之一。因此，建立花葉良姜高頻高效離體再生體系，對(duì)花葉良姜高效繁殖具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，對(duì)花葉良姜組織培養(yǎng)的研究不多。潘梅等（2012）以花葉艷山姜莖尖為外植體研究其離體快繁技術(shù)，結(jié)果表明，其芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖培養(yǎng)基為2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍數(shù)達(dá)4.0倍，生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0～1.5 mg/L NAA，生根率為93.0%，移栽基質(zhì)為河沙∶珍珠巖∶表土=1∶1∶1。黃賽等（2013）以花葉艷山姜種子為外植體，表面消毒以70%酒精預(yù)處理10 s，再用1.0 g/L升汞浸泡5 min，消毒效果佳；種子在MS培養(yǎng)基上即可萌芽；叢生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基上增殖速度快，增殖倍數(shù)達(dá)4.3倍；芽苗在MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L AC培養(yǎng)基上生根率為94.5%；組培苗移栽在河沙∶腐質(zhì)土∶椰糠（1∶1∶1）的混合基質(zhì)中，成活率達(dá)92.0%。秦麗鳳等（2013）以花葉良姜塊莖為外植體建立了其組織培養(yǎng)體系，叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，增殖倍數(shù)達(dá)3.8倍，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1～0.5 mg/L IBA+ 0.15% AC，生根率為100.0%。陳玉梅（2014）以花葉良姜根狀莖為外植體，經(jīng)初代培養(yǎng)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)，獲得了花葉良姜的組培苗，增殖系數(shù)最高為7.03，有效苗率（苗生根率）為62.13%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有對(duì)花葉良姜的研究主要利用根狀莖和莖尖誘導(dǎo)叢生芽、以芽繁芽的方法進(jìn)行繁殖，存在增殖系數(shù)較低等問(wèn)題，而通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織和分化不定芽途徑進(jìn)行植株再生的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以花葉良姜種子為材料，經(jīng)無(wú)菌萌發(fā)從而建立離體再生體系，為周年規(guī)?；a(chǎn)花葉良姜種苗提供一種新的、高效的繁殖方法，也為其育種和遺傳轉(zhuǎn)化等基因工程研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試花葉良姜成熟種子由廣西林業(yè)科學(xué)研究院提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 種子預(yù)處理及無(wú)菌萌發(fā) 將花葉良姜種子用800倍高錳酸鉀溶液浸種20 min后清水沖洗10 min，再用濃硫酸預(yù)處理5 min，清水沖洗30 min，按表1的方案進(jìn)行處理后，接種到MS培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計(jì)污染率和萌發(fā)率。每處理接種40粒種子，3次重復(fù)。

污染率（%）=污染種子數(shù)/接種種子數(shù)×100

發(fā)芽率（%）=萌發(fā)種子數(shù)/接種種子數(shù)×100

1. 2. 2 愈傷組織誘導(dǎo) 切取通過(guò)種子萌發(fā)得到無(wú)菌苗的葉片，切割成5 mm×5 mm小塊，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2）上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，設(shè)Y1～Y9處理，每處理接種50小塊，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率。

愈傷誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷數(shù)/接種葉片塊數(shù)×100

1. 2. 3 愈傷組織分化 將愈傷組織切割成5 mm×5 mm小塊，接種于分化培養(yǎng)基（表3）上，設(shè)F1～F9處理，每處理接種50塊，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)分化系數(shù)。

分化系數(shù)=分化芽數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)

1. 2. 4 生根培養(yǎng) 當(dāng)愈傷組織分化的不定芽高3～4 cm時(shí)，接種于生根培養(yǎng)基（表4）上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每處理接種量為50株，設(shè)S1～S10處理，每處理3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率（%）=生根數(shù)/接種不定芽數(shù)×100

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 花葉良姜種子的滅菌及無(wú)菌萌發(fā)

由表5可知，無(wú)菌萌發(fā)花葉良姜種子的污染率表現(xiàn)為處理5>處理1>處理4>處理2>處理6>處理3。其中，處理1的污染率與處理5差異不顯著（P>0.05，下同），但二者與其他處理差異顯著（P<0.05，下同），處理2、3、4、6相互間差異顯著。說(shuō)明花葉良姜種子的污染率隨著升汞和次氯酸鈉滅菌時(shí)間不同而發(fā)生改變，使用滅菌劑種類少、時(shí)間短，則污染率高，滅菌時(shí)間長(zhǎng)則污染率低。從萌發(fā)率來(lái)看，處理3的萌發(fā)率最高，為75.83%，其次為處理6，為60.83%，隨后是處理2，為22.50%，處理1、4和5的萌芽率較低。其中，處理3、6、2的萌芽率間差異顯著，且均顯著高于處理1、4和5，處理1、4和5間差異不顯著。綜上所述，處理3花葉良姜種子的污染率低，萌發(fā)率高，種子萌發(fā)生長(zhǎng)好，子葉生長(zhǎng)快（圖1-A），滅菌效果最佳。因此，適宜花葉良姜種子滅菌的方法為：先用75%乙醇消毒60 s，然后用0.1%升汞消毒10 min，最后用5%次氯酸鈉消毒3 min。

2. 2 花葉良姜種子的愈傷組織誘導(dǎo)

由表6可知，處理Y1、Y2和Y3的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，相互間差異不顯著；處理Y4、Y5和Y6的愈傷組織誘導(dǎo)率中等，其中，處理Y4與Y6差異不顯著，處理Y5與Y6差異不顯著，但三者均顯著高于處理Y1、Y2和Y3；處理Y7、Y8和Y9的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，三者間差異不顯著，但均顯著高于處理Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6，且愈傷組織為黃色，質(zhì)地疏松（圖1-B）。說(shuō)明在MS中僅單獨(dú)添加6-BA或NAA或2，4-D的培養(yǎng)基其愈傷誘導(dǎo)率較低，即單獨(dú)使用一種激素不利于愈傷組織誘導(dǎo)，而將生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素配合使用時(shí)愈傷誘導(dǎo)率明顯升高，其中，6-BA與2，4-D配合使用時(shí)愈傷誘導(dǎo)率顯著高于6-BA與NAA配合使用。因此，適宜花葉良姜愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2，4-D。

2. 3 花葉良姜種子的愈傷組織分化

由表7可知，處理F8的愈傷組織分化系數(shù)最大（10.03），且顯著大于處理F1（4.71）、F4（6.38）和F7（8.94），說(shuō)明含TDZ培養(yǎng)基比含6-BA培養(yǎng)基更有利于花葉良姜種子的愈傷組織分化，尤以2.00 mg/L TDZ對(duì)愈傷組織分化的效果更佳；在2，4-D濃度同為0.05 mg/L的情況下，處理F5的愈傷組織分化系數(shù)高于處理F6，但差異不顯著；在2，4-D濃度同為0.10 mg/L的情況下，處理F7和F8植株長(zhǎng)勢(shì)好（圖1-C），但處理F8的愈傷組織分化系數(shù)顯著高于處理F7。因此，確定適宜花葉良姜愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+2.00 mg/L TDZ+0.10 mg/L 2，4-D。

2. 4 花葉良姜種子分化苗的生根培養(yǎng)

由表8可知，處理S2的生根率顯著高于處理S1，二者的生根數(shù)和根長(zhǎng)差異雖不顯著，但仍以處理S2略優(yōu)于處理S1，說(shuō)明不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基比不添加任何激素的MS培養(yǎng)基更有利于花葉良姜分化苗生根。處理S3與S4、處理S5與S6、處理S7與S8、處理S9與S10的生根率差異不顯著，說(shuō)明在MS和1/2MS培養(yǎng)基中，不管是添加0.50或1.00 mg/L IBA還是添加0.50或1.00 mg/L ABT1號(hào)生根粉，激素濃度對(duì)花葉良姜分化苗生根率的影響均不明顯。從表8還可看出，處理S7和S8的生根率和生根數(shù)分別顯著高于處理S9和S10，說(shuō)明花葉良姜分化苗生根率受激素種類的影響顯著。綜上所述知，在1/2MS+1.00 mg/L ABT1號(hào)生根粉培養(yǎng)基中，花葉良姜分化苗的生根率達(dá)98.00%，平均根數(shù)為4.23條，平均根長(zhǎng)度為3.12 cm，小苗長(zhǎng)勢(shì)好（圖1-D），因此，1/2MS+1.00 mg/L ABT1號(hào)生根粉可作為花葉良姜分化苗的最佳生根培養(yǎng)基。

3 討論

離體形態(tài)發(fā)生的途徑包括愈傷分化途徑和不定芽途徑，兩個(gè)途徑的區(qū)別在于是否經(jīng)過(guò)愈傷組織階段。目前，花葉良姜離體快繁體系的建立多數(shù)是通過(guò)不定芽途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)愈傷組織途徑建立的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究在花葉良姜種子無(wú)菌萌發(fā)后，以其葉片為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)，建立了其高頻高效的再生體系。其中，愈傷組織的誘導(dǎo)和分化受細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素影響明顯，細(xì)胞分裂素以人工合成激素TDZ為主，其活性比6-BA更高，當(dāng)濃度為2.00 mg/L時(shí)能促進(jìn)不定芽分化，在低濃度范圍（0.20～0.50 mg/L）則有利于不定芽增殖。

在生根培養(yǎng)中，生根效果受基本培養(yǎng)基種類和激素種類的影響較大，不添加任何激素的生根率低、根系少、根短，與趙秀芳（2004）對(duì)花葉艷山姜的研究結(jié)果不一致，可能是試驗(yàn)用植株的個(gè)體存在差異所造成，但也不排除趙秀芳（2004）研究中使用活性炭對(duì)生根的促進(jìn)作用。本研究中以1/2MS為基本培養(yǎng)基的生根效果較MS優(yōu)，與朱立明（2011）對(duì)非洲紫羅蘭、王明瑩等（2013）對(duì)藍(lán)莓美登、饒寶蓉等（2014）對(duì)藍(lán)莓夏普藍(lán)、呂德任等（2015）對(duì)花葉艷山姜的研究結(jié)果一致，即MS含有高濃度的無(wú)機(jī)鹽，能促進(jìn)地上部?jī)?yōu)先生長(zhǎng)，進(jìn)一步加強(qiáng)頂端優(yōu)勢(shì)，1/2MS含有較低濃度的無(wú)機(jī)鹽，則有利于地下部?jī)?yōu)先生長(zhǎng)，從而促進(jìn)生根。在傳統(tǒng)的生根培養(yǎng)中，激素的使用多數(shù)以IBA、NAA等生長(zhǎng)激素類為主，本研究將ABT1號(hào)生根粉應(yīng)用于花葉良姜組織培養(yǎng)，取得了良好的生根效果，與李正平（1985）在月季組織培養(yǎng)中使用ABT生根粉的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)途徑可以建立花葉良姜的離體再生體系。

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（責(zé)任編輯 思利華）