黃喉擬水龜白眼病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

陸專靈 鐘一治 趙忠添 雷燕 韋友傳 張益峰

摘要：【目的】明確黃喉擬水龜白眼病的病原菌及其藥敏特性，為該病的防控提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉?duì)患白眼病的黃喉擬水龜進(jìn)行無菌解剖、劃線培養(yǎng)、分離篩選，對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行培養(yǎng)特征、生理生化特性鑒定、16S rDNA序列分析及同源性比對(duì)分析，通過動(dòng)物致病性試驗(yàn)鑒定致病性，并采用藥敏試驗(yàn)檢驗(yàn)其耐藥性?！窘Y(jié)果】從患白眼病黃喉擬水龜稚龜肝臟、肺臟及脾臟中分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)小白鼠和黃喉擬水龜均有強(qiáng)的致病性，為兼性厭氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、發(fā)酵型、無運(yùn)動(dòng)能力的革蘭氏陰性桿菌，其16S rDNA序列（GenBank登錄號(hào)KU855372）與肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的同源性達(dá)99.1%。分離菌株對(duì)恩諾沙星、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氧氟沙星等高度敏感，但對(duì)鏈霉素、新霉素、青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明等已產(chǎn)生耐藥性。【結(jié)論】肺炎克雷伯菌是引起黃喉擬水龜白眼病的主要病原菌，生產(chǎn)中可選用恩諾沙星、氧氟沙星等沙星類或頭孢噻吩、頭孢噻肟等頭孢類藥物進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 黃喉擬水龜；白眼病；分離；鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S947.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）11-1974-05

Abstract：【Objective】Pathogen of withe eye disease in Mauremys mutica and its drug sensitivity characteristics were confirmed in order to provide reference for prevention and control of the disease. 【Method】Sterile anatomy， streak culture， isolation and selection were applied on M. muticas with withe eye disease. Cultural characteristics and physiological and biochemical characteristics of the isolated strains were identified， 16S rDNA sequence analysis and homology comparison were conducted. Pathogenicity was identified through animal pathogenic experiment and drug resistance was identified through drug sensitivity test. 【Result】A dominant strain was isolated from liver， lung and spleen of M. mutica with withe eye disease， which was strongly pathogenic to mice and M. mutica. The isolated strain was identified to be a gram-negative bacillus with facultative anaerobic， acidogenicity， aerogenesis， fermentation and no exercise ability. The 16S rDNA sequences of the isolated strain（GenBank accession number： KU855372） and that of Klebsiella pneumoniae had 99.1% homology. The isolated strain was hypersensitive to enrofloxacin， cephalothin， cefotaxime and ofloxacin， but showed drug resistance to streptomycin， neomycin， penicillin， kanamycin， tetracycline， clindamycin， doxycycline， amoxicillin and compound sulfamethoxazole. 【Conclusion】K. pneumoniae is one of the main pathogenic bacteria causing withe eye disease of M. mutica. Quinolone and cephalosporin analogues such as enrofloxacin， ofloxacin cephalothin and cefotaxime can be used to prevent and control the disease.

Key words： Mauremys mutica； withe eye disease； isolation； identification； drug sensitivity test

0 引言

【研究意義】黃喉擬水龜（Mauremys mutica）隸屬于龜鱉目淡水龜科，自然分布于越南、日本及我國的東部和南部等地，是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的擬水龜品種之一（趙忠添等，2007）。黃喉擬水龜在稚龜階段極易發(fā)生白眼病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為眼部發(fā)炎充血、眼睛腫大、眼睛外表有黃白色分泌物，病龜精神不振、反應(yīng)遲頓，不時(shí)用前肢抓撓眼部，常浮在水面、張口呼吸，嘴角流出黏液等。由于病龜長期不攝食，加上體內(nèi)器官受病菌感染，最終衰竭死亡（趙忠添，2006），給黃喉擬水龜養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)龜鱉類白眼病的研究報(bào)道較少，對(duì)其病原菌的鑒定結(jié)果也各不相同。伍惠生（2001）推測(cè)烏龜眼部受細(xì)菌感染可導(dǎo)致白眼病，使用呋喃類、紅霉素等藥物進(jìn)行防治有一定效果；章劍（2001）初步鑒定鱷龜白眼病的病原為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）；于清泉（2003）研究發(fā)現(xiàn)，在龜白眼病初期可選用利福平眼藥水滴眼、麥迪霉素片拌料或鏈霉素腹腔注射，均可獲得良好的防效；趙忠添（2006）對(duì)黃喉擬水龜白眼病進(jìn)行防治初探，發(fā)現(xiàn)鏈霉素、羅紅霉素等抗菌素對(duì)黃喉擬水龜白眼病治療有一定作用；萬輯（2007）研究表明，七彩龜白眼病是由細(xì)菌感染引起，但未明確具體病原菌；楊瑞婷（2014）研究發(fā)現(xiàn)巴西龜白眼病的病原菌主要是革蘭氏陰性菌，與巴西龜腸道菌群檢出情況相似；李建華和胡大勝（2014）在對(duì)廣西擬水龜幼龜白眼病進(jìn)行診斷時(shí)，確診其病原菌為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。【本研究切入點(diǎn)】實(shí)際生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，白眼病對(duì)12～30 g的稚龜有較強(qiáng)傳染性，病情發(fā)展迅速，若處理不當(dāng)死亡率可達(dá)20%～50%，但至今除了趙忠添（2006）對(duì)黃喉擬水龜白眼病進(jìn)行防治初探外，未見其他相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)患白眼病的黃喉擬水龜進(jìn)行無菌解剖和病原分離，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)特征、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列分析及動(dòng)物致病性試驗(yàn)鑒定其病原菌，并通過藥敏試驗(yàn)分析病原菌的藥物敏感性，以期為黃喉擬水龜白眼病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

患白眼病黃喉擬水龜采自南寧市某龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)，健康黃喉擬水龜稚龜（10～30 g）由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬基地提供，4周齡健康小白鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。普通瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室配制；血瓊脂培養(yǎng)基購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片購自上海金穗生物科技有限公司；Ex-Taq、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸蕴旄萍迹ū本┯邢薰?。

1. 2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及理化鑒定

無菌剖檢病龜，用接種環(huán)在其肝臟、肺臟、脾臟等組織上取樣接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。挑選單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃純化培育16 h。純化的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后，于顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)菌鞭毛用硝酸鹽染色。同時(shí)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、M.R.、V-P、硫化氫、枸櫞酸鹽、吲哚、硝酸鹽、明膠、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶、動(dòng)力試驗(yàn)等生理生化鑒定，具體操作參照東秀珠和蔡妙英（2001）的方法。

1. 3 動(dòng)物試驗(yàn)

將分離純化后的菌株接種于新鮮普通瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h后用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，采用比濁法進(jìn)行計(jì)數(shù)，將菌懸液稀釋為1×108 CFU/mL。選用4周齡健康小白鼠和健康黃喉擬水龜稚龜進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，其中，小白鼠試驗(yàn)分別設(shè)試驗(yàn)組（15只）和對(duì)照組（15只），試驗(yàn)組經(jīng)小白鼠腹腔注射菌懸液100 μL/只，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水；黃喉擬水龜試驗(yàn)也設(shè)試驗(yàn)組（9只）和對(duì)照組（9只），試驗(yàn)組稚龜經(jīng)腹腔注射菌懸液100 μL/只，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物在同一環(huán)境下養(yǎng)殖，每天觀察小白鼠和黃喉擬水龜?shù)陌l(fā)病、死亡情況，連續(xù)觀察10 d，并對(duì)死亡的試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行剖檢和病原菌分離鑒定。

1. 4 16S rDNA序列分析

分離菌株經(jīng)37 ℃搖床（200 r/min）培養(yǎng)16 h后，取1.5 mL于4 ℃下12000 r/min離心1 min，抽提細(xì)菌總DNA。PCR反應(yīng)體系50.0 μL，其中10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物16S-F（5'-AGAGTTTGAT

CMTGGCTCAG-3'）1.0 μL，下游引物16S-R（5'-TACG

GYTACCTTGTTACGACTT-3'）1.0 μL，Ex-Taq 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 39.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，預(yù)擴(kuò)增片段1501 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收后連接至pMD18-T載體，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并用MAGE 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 5 藥敏試驗(yàn)

將分離純化的菌株涂布在普通瓊脂培養(yǎng)基上，然后分別貼上藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量各抗菌藥的抑菌圈直徑，評(píng)判分離菌株的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃喉擬水龜白眼病的臨床癥狀及其病理變化

黃喉擬水龜白眼病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為眼睛發(fā)炎、腫大、充血，眼瞼黏膜糜爛、眼睛外表覆蓋黃白色分泌物（圖1）；病情嚴(yán)重時(shí)鼻子及嘴巴黏膜潰爛、不時(shí)有黏液流出，張口呼吸。其剖檢病理變化表現(xiàn)為肝臟有針狀出血、瘀血，嚴(yán)重時(shí)有大塊瘀血斑；肺部有積液、充血，或有較多氣泡，咽喉紅腫充血。

2. 2 分離菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果

分離菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長成淺白色、透明、圓形凸起、邊緣光滑的菌落，菌落直徑0.4～1.5 mm。分離菌株為革蘭氏陰性桿菌，菌體兩端頓圓，呈單個(gè)或短鏈狀排列（圖2）。對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果顯示該菌表現(xiàn)為兼性厭氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、發(fā)酵型、無運(yùn)動(dòng)能力的革蘭氏陰性桿菌（表1），與肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的生理生化特性高度相似。

2. 3 分離菌株的動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

小白鼠人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，小白鼠在注射接種菌懸液后10 h開始發(fā)病，24 h內(nèi)全部死亡。黃喉擬水龜人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，黃喉擬水龜在注射接種菌懸液后24 h開始發(fā)病，病龜表現(xiàn)出精神萎靡不振、反應(yīng)遲頓、呼吸困難、眼部發(fā)炎充血等癥狀，從第2 d開始有病龜死亡，至第7 d試驗(yàn)組黃喉擬水龜全部死亡；剖檢發(fā)現(xiàn)，其病理變化表現(xiàn)為肝臟腫脹、有出血點(diǎn)，脾臟腫大，肺臟充血水腫。對(duì)照組的小白鼠和黃喉擬水龜均未發(fā)病或死亡。從發(fā)病死亡小白鼠、黃喉擬水龜?shù)姆闻K和肝臟均能分離獲得與接種菌株一致的病原菌。

2. 4 分離菌的16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增分離菌株的16S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約1500 bp（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致。將純化回收的目的片段送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，其GenBank登錄號(hào)為KU855372。將分離菌株的16S rDNA序列與GenBank已知菌株的16S rDNA進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分離菌株與肺炎克雷伯菌的同源性最高，為99.1%。用MAGE 5.0構(gòu)建基于16S rDNA序列的腸桿菌科及革蘭氏陰性菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)分離菌株與肺炎克雷伯菌同屬于一個(gè)群體（圖4），即確定分離菌株為肺炎克雷伯菌。

2. 5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)恩諾沙星、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氧氟沙星等高度敏感，對(duì)多粘菌素、痢特靈、頭孢氨芐、慶大霉素、痢特靈、環(huán)丙沙星等中度敏感，對(duì)鏈霉素、新霉素、青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明等已產(chǎn)生耐藥性（表2）。

3 討論

肺炎克雷伯菌為革蘭氏陰性菌，隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（Klebsiella），通常寄生于動(dòng)物呼吸道和腸道內(nèi)，對(duì)動(dòng)物有強(qiáng)致病性（Brisse and Duijkeren，2005；賈艷等，2006）。目前，已從多種哺乳動(dòng)物及水生動(dòng)物中分離獲得肺炎克雷伯菌，其病理變化主要集中在肝臟、肺臟、呼吸道及腸道。徐海圣和舒妙安（2002）從患病中華鱉的病料中分離獲得肺炎克雷伯菌，其病理變化為全身浮腫、腹腔內(nèi)有積液，肝臟呈花斑狀，肺部充血發(fā)黑。本研究從患白眼病黃喉擬水龜?shù)母闻K、肺臟和脾臟中分離獲得一株優(yōu)勢(shì)菌株，其培養(yǎng)特性、生理生化鑒定結(jié)果初步確定為肺炎克雷伯菌；將分離菌株的16S rDNA序列與肺炎克雷伯菌進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者的同源性為99.1%；由基于16S rDNA序列的腸桿菌科及革蘭氏陰性菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也發(fā)現(xiàn)分離菌株與肺炎克雷伯菌同屬于一個(gè)群體，即確定分離菌株為肺炎克雷伯菌。本研究剖檢發(fā)現(xiàn)患白眼病黃喉擬水龜?shù)闹饕±碜兓癁楦闻K、肺臟和呼吸道損傷，與趙忠添（2006）、李建華和胡大勝（2014）的剖檢結(jié)果相似，在病情嚴(yán)重時(shí)才表現(xiàn)出眼部感染發(fā)炎，即肺臟、肝臟受損才是患白眼病龜鱉死亡的主要原因。

本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，從患白眼病黃喉擬水龜肝臟、肺臟及脾臟中分離獲得的肺炎克雷伯菌對(duì)鏈霉素、新霉素、青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明等已產(chǎn)生耐藥性，可能與肺炎克雷伯菌的廣泛耐藥性有密切關(guān)系。劉保光等（2014）研究表明，β-內(nèi)酰胺類抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的有效藥物，但隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素在臨床治療中的大量應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，致使肺炎克雷伯菌耐藥性逐年提高。林星宇等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，豬源肺炎克雷伯菌對(duì)青霉素類及青霉素類復(fù)合制劑不敏感，且對(duì)部分頭孢類抗生素表現(xiàn)出低程度耐藥，表明其可能含有β-內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)生了耐藥性。因此，在黃喉擬水龜白眼病的防治中應(yīng)引起高度重視，必須始終貫徹以防為主的指導(dǎo)思想，從正規(guī)良種場(chǎng)購買或引進(jìn)優(yōu)質(zhì)種苗；養(yǎng)殖過程中注意環(huán)境衛(wèi)生、控制養(yǎng)殖密度，采取仿生態(tài)養(yǎng)殖模式；治療時(shí)應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)用藥，減少廣譜抗生素的使用，避免產(chǎn)生耐藥性。

4 結(jié)論

肺炎克雷伯菌是引起黃喉擬水龜白眼病的主要病原菌，生產(chǎn)中可選用恩諾沙星、氧氟沙星等沙星類或頭孢噻吩、頭孢噻肟等頭孢類藥物進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）