無患子優(yōu)選樹莖段離體培養(yǎng)體系的建立

邢建宏 馮永濤 黃應(yīng)德 劉希華

摘要：【目的】篩選無患子莖段離體快繁最佳培養(yǎng)基，建立無患子優(yōu)良種苗快速繁育體系?！痉椒ā恳砸巴膺x優(yōu)獲得的無患子樹帶腋芽莖段為外植體，采用L9（33）正交試驗(yàn)對影響外植體滅菌的HgCl2濃度、HgCl2與酒精的作用時間，不定芽誘導(dǎo)萌發(fā)中的6-BA、NAA及蔗糖用量，繼代增殖中6-BA與KT用量和芽苗生根中的MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽水平、6-BA和2，4-D用量進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】75%酒精浸泡1 min，再用0.2% HgCl2處理7 min是無患子莖段滅菌的最佳方法，其外植體成活率高達(dá)83.33%；MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖是無患子莖段腋芽萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率高達(dá)96.67%；MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT是無患子莖段腋芽增殖的適宜培養(yǎng)基，30 d可增殖4.13倍；1/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D是誘導(dǎo)芽苗生根的適宜培養(yǎng)基，平均生根率為41.50%。【結(jié)論】建立的無患子離體培養(yǎng)體系為：外植體莖段用75%酒精浸泡1 min，再用0.2% HgCl2滅菌7 min，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，在MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞： 無患子；莖段；組織培養(yǎng)體系

中圖分類號： S722.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1903-06

Abstract：【Objective】In this paper， the optimal medium of in vitro rapid propagation was selected in order to establish rapid culture system for Sapindus mukorossi Gaertn seedlings. 【Method】Taking S. mukorossi selective stems with axillary buds as explants，the concentration of HgCl2， action time of HgCl2 and alcohol in explants sterilization， the contents of 6-BA， NAA and sucrose in adventitious bud induction， the dosages of 6-BA and KT in shoot proliferation， and inorganic salt levels in MS， dosages of 6-BA and 2，4-D in seedling rooting was optimized by orthogonal experiment design L9（33）. 【Result】The optimum stem sterilization method for S. mukorossi was as follows： immersing the stem in 75% alcohol for 1 min， and sterilized with 0.2% HgCl2 for 7 min. After this treatment， survival rate of explants was 83.33%. MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L sucrose was the most appropriate culture medium for axillary bud induction， and the induction rate was 96.67%. MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT was the best culture medium for axillary bud proliferation， and the proliferation multiple was 4.13 times after 30 days. 1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D was the best culture medium for rooting，and the average rooting rate was 41.50%. 【Conclusion】The in vitro culture system of S. mukorossi established preliminarily is as follows： immersing the stem explants in 75% alcohol for 1 min， sterilizing them with 0.2% HgCl2 7 min， using medium of MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L sucrose to induce axillary bud germination， putting them in MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT medium for multiplication culture， and using 1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D medium for rooting.

Key words： Sapindus mukorossi Gaertn； stem； tissue culture system

0 引言

【研究意義】無患子（Sapindus mukorossi Gaertn）又名木患子、洗手果、油患子，為無患子科（Sapindaceae）落葉喬木（中國科學(xué)院中國植物志編委會，1998），其種仁含油率在40%以上，是生產(chǎn)生物柴油的理想原料（羅艷和劉梅，2007），其假種皮中含37%皂素，是生產(chǎn)農(nóng)藥乳化劑（錄麗平等，2010）和純天然洗滌產(chǎn)品（徐凱節(jié)等，2013）的優(yōu)良原料；果皮提取物具有抗菌防癌功效，在醫(yī)藥保健領(lǐng)域極具開發(fā)潛力（Takagi et al.，1980；Tamura和史青，2002）；樹形優(yōu)美，是優(yōu)良的園林綠化樹種和高檔用材樹種（黃素梅等，2009；周愛紅，2011）。近年來，無患子已在臺灣、福建及四川等地開始規(guī)?；N植，但優(yōu)質(zhì)種苗供應(yīng)嚴(yán)重不足。無患子主要依靠種子實(shí)生繁殖（尹道剛等，2011），其后代性狀分化較明顯，優(yōu)良性狀難以保持，而通過扦插、嫁接等無性繁殖手段的成活率較低（陳碧華等，2012），難以滿足生產(chǎn)需求。因此，探討無患子組培培養(yǎng)技術(shù)，對其優(yōu)良種苗快速繁育及良種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】張鳳龍（2005）進(jìn)行無患子組織培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)無患子莖段越冬芽是進(jìn)行組織培養(yǎng)的理想外植體，但所使用的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)率和增殖率較低。陳光蓉等（2007）探討無患子愈傷組織的誘導(dǎo)條件，篩選出葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS（B5）+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)97.78%。周倩等（2012）開展無患子愈傷組織誘導(dǎo)與芽苗增殖試驗(yàn)，獲得了培養(yǎng)基配方，但未進(jìn)行繼代增殖和生根培養(yǎng)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對野生無患子組織培養(yǎng)的研究多數(shù)停留在初代培養(yǎng)技術(shù)的探索階段，誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)均較低，未能在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，針對經(jīng)優(yōu)選獲得無患子建立離體培養(yǎng)體系的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用選優(yōu)獲得的無患子莖段為材料，探索不經(jīng)愈傷組織階段直接誘導(dǎo)腋芽萌動并培養(yǎng)成苗的條件，為無患子優(yōu)良種苗快速繁育及良種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試無患子樹是按照主要指標(biāo)法對鮮果產(chǎn)量、果皮皂素含量和種仁油脂含量進(jìn)行初選、復(fù)選、決選程序從福建三明市野生無患子中選優(yōu)獲得。在連續(xù)3 d晴天的中午剪取生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條作外植體。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體滅菌 將采回的枝條去除葉片后剪成5～6 cm長帶腋芽莖段，用洗衣粉溶液和多菌靈溶液分別浸泡30 min，自來水漂洗2～3 h，在超凈工作臺上將其剪成約1 cm長的帶腋芽莖段，用75%酒精和一定濃度HgCl2溶液進(jìn)行消毒（設(shè)8個滅菌處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1），并用無菌水沖洗5～6遍后接種。每處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)接種20個外植體（下同）。

1. 2. 2 外植體啟動培養(yǎng)基篩選 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以MS為基本培養(yǎng)基，以6-BA、NAA和蔗糖3個因素為參選因素，采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，篩選無患子莖段誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基組分。

1. 2. 3 增殖培養(yǎng)基篩選 選取誘導(dǎo)獲得生長健康、高2～3 cm的腋芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)9種增殖培養(yǎng)基，篩選適宜無患子腋芽增殖的6-BA和KT濃度。

1. 2. 4 生根培養(yǎng)基篩選 挑選增殖培養(yǎng)獲得不定芽中健壯的芽體接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。以MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽水平、6-BA和2，4-D用量為參選因素，應(yīng)用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種生根培養(yǎng)基，篩選適宜芽苗生根的培養(yǎng)基。

除啟動培養(yǎng)基外，上述培養(yǎng)基均附加7.0 g/L瓊脂和30.0 g/L蔗糖，pH 5.8，121 ℃滅菌20 min。接種苗培養(yǎng)溫度為（26±2）℃，光照強(qiáng)度為2000～3000 lx，光照時間為12 h/d。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。誘導(dǎo)率和生根率數(shù)據(jù)先進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再根據(jù)正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 無患子莖段外植體滅菌方法的篩選

由表1可知，滅菌處理4（75%酒精浸泡1 min，0.2% HgCl2處理7 min）是理想的外植體滅菌處理，其成活率最高，為83.33%，顯著高于其他7個滅菌處理（P<0.05，下同）；其污染率較低，為3.88%，顯著低于處理1和2，與滅菌處理3、5、6、7和8差異不顯著（P>0.05，下同）。說明HgCl2的滅菌效果優(yōu)于酒精。由表1還可看出，無患子帶腋芽莖段適宜的HgCl2和75%酒精滅菌時間分別為7～9和1 min。說明通過延長酒精處理時間和提高HgCl2質(zhì)量濃度來縮短HgCl2滅菌時間，可減輕消毒液對外植體的毒害作用，從根本上提高成活率。

2. 2 無患子莖段啟動培養(yǎng)基的篩選

為了減少誘導(dǎo)培養(yǎng)中的污染，在外植體接種3 d后，將無污染的莖段轉(zhuǎn)接于不同組分MS培養(yǎng)基中，30 d后觀察生長狀況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，并進(jìn)行極差分析和方差分析。由表2可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)基8（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖）的誘導(dǎo)率最高，達(dá)96.67%，顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)基1～6；芽開始分化時間較短，為4.33 d，比誘導(dǎo)培養(yǎng)基3、5和9略長，但差異不顯著。對比極差分析結(jié)果中3個因素的k可知，莖段啟動培養(yǎng)基中各因素最優(yōu)組合為A3B2C1，從R大小可知，3個因素對誘導(dǎo)率影響的排為A>B>C，即3個因素對無患子腋芽誘導(dǎo)作用的強(qiáng)弱為6-BA>NAA>蔗糖，其最佳濃度組合為誘導(dǎo)培養(yǎng)基8中的組合。3個因素對無患子莖段腋芽誘導(dǎo)率的方差分析結(jié)果（表3）顯示，6-BA對無患子莖段腋芽的誘導(dǎo)作用達(dá)顯著水平（P=0.0354<0.05），NAA和蔗糖的作用未達(dá)顯著水平。綜上所述，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖是適宜無患子莖段離體培養(yǎng)的啟動培養(yǎng)基。

2. 3 無患子莖段腋芽增殖培養(yǎng)基的篩選

在叢生芽長至2～3 cm高時，將其切成單芽接種于增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)和苗高。由表4可知，增殖培養(yǎng)基2（MS+0.7 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L KT）的增殖效果最佳，培養(yǎng)30 d增殖了4.13倍，顯著高于增殖培養(yǎng)基1、4和7；其苗高達(dá)3.10 cm，顯著高于增殖培養(yǎng)基1、4和7，略低于培養(yǎng)基3，但差異不顯著。6-BA和KT對無患子莖段腋芽增殖倍數(shù)的方差分析結(jié)果（表5）顯示，KT對叢生芽的繼代增殖作用達(dá)顯著水平（P=0.0232<0.05），6-BA對叢生芽的繼代增殖作用未達(dá)顯著水平。對繼代苗生長性狀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基2中腋芽接種3 d左右莖尖膨大形成小芽點(diǎn)，7 d左右單芽基部不斷有新的不定芽產(chǎn)生，18～20 d在小芽基部一般有2～4個叢生芽，30 d增殖系數(shù)達(dá)高峰，且芽健壯、葉片較綠。說明MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT是適宜無患子莖段腋芽增殖的培養(yǎng)基。

2. 4 無患子莖段腋芽增殖苗生根培養(yǎng)基的篩選

選取生長一致、高度大于3.00 cm的增殖苗單個轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)約15 d芽體基部可見細(xì)小不定根根尖長出，20 d時不定根分化達(dá)到高峰，30 d 時不定根由白色變?yōu)榛疑?種生根培養(yǎng)基上增殖苗生根情況見表6。

由表6可知，無患子增殖苗在9種生根培養(yǎng)基中生根情況差異明顯，其中在生根培養(yǎng)基7（1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D）中生根率最高，為41.50%，顯著高于其他8種生根培養(yǎng)基；生根數(shù)較多，為2.63條，顯著多于生根培養(yǎng)基2、3、5、6、8和9，少于生根培養(yǎng)基1但差異不顯著；根長達(dá)3.71 cm，顯著長于生根培養(yǎng)基2、3、5、6、8和9；生根時間最早，為12.33 d，顯著早于除生根培養(yǎng)基4外的其他生根培養(yǎng)基。對比生根率極差分析結(jié)果（表6）中3個因素的k可知，生根培養(yǎng)基中各因素最優(yōu)組合為A3B1C3，從R大小可知，3個因素對誘導(dǎo)率影響的排序?yàn)锽>A>C，即3個因素對無患子莖段腋芽增殖苗生根作用強(qiáng)弱為6-BA濃度>MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽水平>2，4-D濃度，生根培養(yǎng)基7的組合為3種因素的最佳組合。對生根率、生根數(shù)、根長和最早生根時間的方差分析結(jié)果（表7）表明，6-BA濃度對生根率、生根數(shù)和最早生根時間的影響達(dá)極顯著水平（P分別為0.0036、0.0046和0.0078，均小于0.01），對根長的影響達(dá)顯著水平（P=0.0151<0.05）；MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽水平對生根率、生根數(shù)和最早生根時間的影響達(dá)顯著水平（P分別為0.0186、0.0396和0.0385，均小于0.05），對根長的影響不顯著。

無患子莖段誘導(dǎo)及植株再生過程見圖1。

3 討論

獲取無菌材料是木本植物組織培養(yǎng)成功的重要環(huán)節(jié)，選擇適宜的季節(jié)和天氣采集外植體并選用合理的消毒方法是降低污染、提高誘導(dǎo)成活率的關(guān)鍵（王蒂，2004）。本研究中無患子優(yōu)選樹生長于野外，在晴天上午采集靠近樹體基部春季新萌發(fā)的嫩枝作外植體，從選材方面為減少外植體污染、提高成活率打下了基礎(chǔ)。

周倩等（2012）的研究結(jié)果表明，無患子1年生幼苗莖段用75%酒精浸洗30 s后再用0.1% HgCl2浸泡4～5 min的滅菌效果最佳。樊靖等（2014）研究認(rèn)為，無菌存活率在受外植體影響的同時，還受到消毒劑種類、濃度及消毒時間的影響。與上述研究結(jié)果相比，本研究優(yōu)化了適合成年無患子樹莖段消毒的酒精和HgCl2濃度及其作用時間，篩選出用75%酒精浸泡外植體1 min、重復(fù)3次，再用0.2% HgCl2處理7 min為最佳滅菌方式。

本研究發(fā)現(xiàn)，在無患子莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)中6-BA對腋芽的誘導(dǎo)作用明顯，與Hagen和Guilfoyle（2002）、陳光蓉等（2007）的研究結(jié)果一致，并篩選出MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖為無患子莖段萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。

周權(quán)男（2014）研究認(rèn)為，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可促進(jìn)試管苗形成不定芽，在增殖中起決定性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，KT對無患子莖段腋芽的繼代增殖作用明顯，與喬夢吉（2013）等對木本植物灰木蓮組織培養(yǎng)的研究結(jié)果一致，并認(rèn)為MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT是無患子莖段腋芽增殖的適宜培養(yǎng)基。本研究還發(fā)現(xiàn)，無患子叢生芽在繼代培養(yǎng)約30 d后，基部會產(chǎn)生愈傷組織，嚴(yán)重影響芽體對營養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致生長不良。因此，無患子莖段腋芽的繼代增殖時間應(yīng)控制在30 d內(nèi)，以減少芽基部愈傷組織的形成，提高繼代增殖效率。

林杰等（2013）的研究結(jié)果顯示，MS培養(yǎng)基的無機(jī)鹽水平和6-BA濃度對經(jīng)葉片愈傷組織誘導(dǎo)獲得的無患子叢生芽生根有顯著影響；張衛(wèi)華等（2014）研究認(rèn)為，木本植物較難生根，而在1/2MS中配合使用IBA和NAA可提高生根率。本研究結(jié)果與其相似，在MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽水平下配合使用6-BA和2，4-D對無患子莖段誘導(dǎo)獲得的增殖苗生根影響顯著，1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D是無患子增殖苗生根的最佳培養(yǎng)基。本研究雖然獲得了生根苗，但還需在此基礎(chǔ)上對無患子莖段離體快繁體系進(jìn)一步優(yōu)化，以滿足無患子優(yōu)良無性系工廠化快繁的要求。

4 結(jié)論

本研究建立了無患子優(yōu)樹莖段離體培養(yǎng)體系，即無患子莖段在75%酒精浸泡1 min，再用0.2% HgCl2滅菌7 min滅菌效果較佳，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)率最高，在MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)增殖倍數(shù)最大，在1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)生根率最高。

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（責(zé)任編輯 思利華）