一株木薯拮抗內(nèi)生細菌CEB33的鑒定及田間防效初步測定

陳奕鵬　霍姍姍　時濤　李超萍　楊揚　蔡吉苗　黃貴修

摘 要 以木薯細菌性萎蔫病病菌為靶標(biāo)，從健康木薯組織中分離獲得一株有較好抑菌作用的內(nèi)生細菌。生理生化測定、形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析表明其為類芽孢桿菌屬。拮抗試驗表明該菌株對木薯細菌性萎蔫病菌、疫霉根腐病菌、棒孢霉葉斑病菌和膠孢炭疽病菌均有較強的抑制作用。田間防控試驗表明該菌株對木薯細菌性萎蔫病有較好的防治效果，具有良好的開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞 木薯；拮抗內(nèi)生細菌；類芽孢桿菌屬

中圖分類號 S435.33 文獻標(biāo)識碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀多年生作物，是和馬鈴薯、甘薯并稱的三大薯類作物之一，是世界上10億人口日常生活中所需熱能的主要來源。木薯塊根富含淀粉，在糧食、飼料加工、工業(yè)原材料等方面均有廣泛的用途[1]。木薯適應(yīng)性強，耐旱耐瘠，主要分布在中南美洲、非洲、東南亞等熱帶地區(qū)和部分亞熱帶地區(qū)。我國木薯主產(chǎn)區(qū)集中在廣西、廣東、海南、云南和福建5個?。▍^(qū)），湖南、四川、貴州和江西等省也有少量栽培[2]。近年來，我國一直是世界上最大的木薯進口國[3]，國內(nèi)木薯生產(chǎn)對相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

和其它作物類似，各類嚴重發(fā)生的病害是木薯相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制性因素之一。細菌性萎蔫病，也稱細菌性枯萎病，是國內(nèi)木薯生產(chǎn)中危害最為嚴重的病害，可造成30%以上的產(chǎn)量損失[4]。疫霉根腐病、棒孢霉葉斑病和炭疽病也是我國木薯中的常見病害[5-7]。目前，國內(nèi)對于木薯病害的防控主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進行防治，成本高且污染環(huán)境。生物防治是未來木薯病害防控技術(shù)研究的主要方向，但相關(guān)研究還很少，特別是木薯內(nèi)源拮抗微生物篩選方面尚無相關(guān)研究。筆者們在前期研究基礎(chǔ)上，開展了木薯拮抗內(nèi)生菌的分離篩選和鑒定工作，獲得了一株對主要木薯病害病原菌有較強拮抗能力的內(nèi)生細菌，本文為主要研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木薯組織樣品和病原菌菌株 健康木薯品種華南5號葉片樣品來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所儋州試驗基地。木薯細菌性萎蔫病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis）菌株GX11、木薯疫霉根腐病菌（Phytophthora palmivora）菌株CPPHN01、棒孢霉葉斑病菌（Corynespora cassiicola）菌株CCCHN01、膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株CCGHN01、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株JM019、多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）菌株ATCC 842T均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基和試劑 病原真菌菌株培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，細菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，配方參見《植病研究方法》[8]；DNA片段回收試劑盒和pMD18-T載體購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶、dNTP和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞購買自天根生化科技（北京）有限公司；引物799F（59-AACAGGATTAGATACCCTG-3′）和1492R（5′-TACG

GCTACCTTGTTACGAGTT-3′），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離和篩選 參照付業(yè)勤等[9]的方法，對木薯葉片樣品進行表面消毒后進行內(nèi)生細菌的分離和純化。菌株的篩選參照潘羨心等[10]的對峙培養(yǎng)法，用木薯細菌性萎蔫病菌作為靶標(biāo)菌。

1.2.2 內(nèi)生細菌抑菌作用評價 菌株對木薯細菌性萎蔫病菌的抑制作用采用牛津杯法進行。將木薯細菌性萎蔫病菌培養(yǎng)至OD600約0.6，按照1 ∶ 20的比例將菌液與滅菌后冷卻至45 ℃的NA培養(yǎng)基混勻后制備帶菌平板。參照潘羨心[10]的方法，制備內(nèi)生細菌的無菌濾液，將牛津杯放置在帶菌平板的中央，加入0.2 mL的濾液，以液體NA培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察抑菌情況，測量抑菌圈直徑。

采用對峙培養(yǎng)法評價內(nèi)生細菌對木薯疫霉根腐病菌、棒孢霉葉斑病菌和膠胞炭疽菌的抑菌作用。將病原菌菌餅接種在PDA平板的中央，將內(nèi)生細菌在菌餅兩側(cè)約3 cm處進行劃線接種，28 劃培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率。

1.2.3 內(nèi)生細菌菌株鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]和《微生物學(xué)實驗》[12]觀察菌株CEB33的培養(yǎng)形態(tài)、性狀、革蘭氏染色反應(yīng)，同時測定菌株的生理生化特征。參照潘羨心[13]的方法進行菌株16S rDNA序列的測定和分析。從數(shù)據(jù)庫中下載近源物種的16S rDNA序列，應(yīng)用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap 對系統(tǒng)樹進行檢驗，1 000次重復(fù)。

1.2.4 內(nèi)生細菌內(nèi)生性測定 參照陳博[14]的方法，用含有氨芐青霉素的液體NA培養(yǎng)基對內(nèi)生細菌菌株進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終獲得對氨芐青霉素具抗性的突變菌株。用針刺法將抗性標(biāo)記菌株接種在木薯華南5號植株的健康葉片上，分別用大腸桿菌菌株JM019和無菌水做對照。28 ℃培養(yǎng)5 d后，取距離接種針刺點約1 cm的葉片組織，參照1.2.1的方法進行內(nèi)生細菌的分離和鑒定。

1.2.5 內(nèi)生細菌對木薯細菌性萎蔫病的田間防控試驗

選擇地勢平坦，土質(zhì)疏松，土壤肥力中等，上一茬種植木薯且細菌性萎蔫病發(fā)生較嚴重的田塊進行。供試木薯品種為華南9號。試驗共設(shè)3個處理和1個空白對照：CEB33菌液（OD600 0.6）、可殺得叁千（46%氫氧化銅WDG，美國杜邦公司生產(chǎn)，稀釋1 500倍）、凈剎（80%乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司生產(chǎn)，稀釋3 000倍）及空白對照（清水），每個處理重復(fù)3次，共12個小區(qū)，小區(qū)面積100 m2，小區(qū)間設(shè)3行保護行，木薯行距100 cm，株距60 cm。

參照盧昕等[15]的方法進行藥劑防效的評價。采用五點取樣法對各個處理小區(qū)進行調(diào)查，每個小區(qū)調(diào)查5個點，每個點3株木薯，共15株；在每株木薯的上、中、下部不同部位各取5張復(fù)葉，共取復(fù)葉15張。按照以下標(biāo)準(zhǔn)進行分級：0級：無任何病斑；1級：病斑總面積占葉片總面積1/16以下；3級：病斑總面積占葉片總面積1/16～1/8；5級：病斑總面積占葉片總面積1/8～1/4；7級：病斑總面積占葉片總面積1/4～1/2；9級：病斑總面積占葉片總面積1/2以上或葉片變黃凋萎。按照以下公式計算各小區(qū)的病情指數(shù)，計算病害減退率，求取校正防效的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SAS9.0軟件進行差異顯著性分析[16]。

病情指數(shù)=（Σ各病級葉片數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病害級數(shù)）×100

病害減退率=（防治前病情指數(shù)-防治后病情指數(shù)）/防治前病情指數(shù)×100%

校正防效=（各處理病害減退率-對照病害減退率）/（100-對照病害減退率）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯內(nèi)生細菌的分離與篩選

本研究從健康木薯葉片中共獲得細菌分離物12株，從中篩選出3株對木薯細菌性萎蔫病病菌有較好拮抗作用的菌株，其中1株菌株的抑菌帶最寬，命名為CEB33。

2.2 CEB33的抑菌作用評價

研究發(fā)現(xiàn)CEB33對木薯細菌性萎蔫病菌有較好的抑菌作用，抑菌圈直徑為17 mm（圖1）。CEB33對木薯疫霉根腐病菌、棒孢霉葉斑病菌和炭疽病菌的抑菌率分別為60.7%、63.2%和43.9%（圖2、3和4）。

2.3 CEB33菌株的鑒定

CEB33在NA平板上的菌落呈乳白色，形狀不規(guī)則，表面光滑，且粘稠程度高，邊緣有較高隆起。菌體短桿狀近球形，有莢膜，大小為（0.6～0.8）μm×（1.0～1.2）μm，革蘭氏染色為陰性，能產(chǎn)生橢圓形芽孢。菌株的生理生化特征測定結(jié)果見表1。

提取CEB33菌株的基因組DNA，用引物對799F和1492R進行PCR擴增后獲得約0.7 kb的擴增產(chǎn)物。該片段克隆測序后，確認其全長為738 nt，堿基序列相似性比對發(fā)現(xiàn)其與類芽孢桿菌菌株CR1（登錄號CP006941.2）、菌株AM49（登錄號NR 025169.1）等的序列同源性為99%。該序列已提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，登錄號為KX822134。從數(shù)據(jù)庫中下載類芽孢桿菌屬14個菌株的16S rDNA序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結(jié)果顯示，該菌株與P. kribbensis AM49（NR025169）聚為一個分枝，和P.peoriae、P. polymyxa等親緣關(guān)系最近，與類芽胞桿菌屬其它種的親緣關(guān)系較遠。菌株形態(tài)觀察、生理生化特征鑒定和16S rDNA 序列聚類分析結(jié)果表明該菌株為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）細菌。

2.4 CEB33菌株內(nèi)生性的鑒定

用含有低濃度氨芐青霉素的液體NA培養(yǎng)基進行CEB33的誘導(dǎo)培養(yǎng)，逐步增加氨芐青霉素的濃度，最終獲得能在含有濃度為300 μg/mL氨芐青霉素的培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長、且菌落形態(tài)及對病原菌的拮抗作用等均保持不變的抗性菌株，命名為CEB33-amp。該菌株接種木薯葉片后，重新分離獲得了培養(yǎng)性狀等特性和CEB33-amp完全一致的培養(yǎng)物，而大腸桿菌和無菌水等對照處理均未分離到類似的抗性細菌。

2.5 CEB33對木薯萎蔫病菌的田間防效評價

2015年，在海南省文昌市邁號鎮(zhèn)進行了CEB33對木薯萎蔫病的防效試驗，3次施藥時間分別為8月26日、9月5日和9月15日。9月25日調(diào)查時發(fā)現(xiàn)3個處理均無藥害產(chǎn)生。其中CEB33的校正防效為55.0%，優(yōu)于氫氧化銅（校正防效37.0%），但差于乙蒜素（校正防效73.0%）（表2）。

3 討論

本研究經(jīng)過嚴格的表面消毒，從健康木薯葉片中分離篩選到一株具有良好拮抗效果的內(nèi)生細菌菌株CEB33，經(jīng)形態(tài)觀察、基礎(chǔ)生理生化特性測定及16S rDNA序列分析，鑒定其為類芽孢桿菌。該菌株對木薯常見病害病原菌均有較好的拮抗作用，田間施用發(fā)現(xiàn)其對木薯萎蔫病菌有較好的防效，表明該菌株在木薯病害防控中有良好的應(yīng)用前景。

植物內(nèi)生細菌是指整個生活史或其部分階段能夠進入活體植物組織內(nèi)，且它們的存在并未使植物組織的表型特征和功能有明顯改變的細菌。和病原細菌不同，內(nèi)生細菌和宿主植物之間是一種共生關(guān)系。宿主植物能夠為生防內(nèi)生細菌提供生存空間、水份和養(yǎng)分，保護其不受外界環(huán)境的影響，和常規(guī)生防相比具有更好的防效穩(wěn)定性。內(nèi)生細菌還可作為外源基因的載體應(yīng)用于生產(chǎn)，因此拮抗性內(nèi)生細菌的研究是近年來生防研究中的熱點。目前研究者幾乎從所有已知的植物中都分離得到了內(nèi)生細菌，本研究也發(fā)現(xiàn)健康的木薯組織中同樣存在著對病原菌有拮抗作用的內(nèi)生細菌。

類芽孢桿菌屬細菌具有生長快、營養(yǎng)簡單、能夠形成具較強抗逆能力的芽孢、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢，是田間生產(chǎn)中應(yīng)用潛力較大的一類菌株[17]。該類生防菌株對水稻紋枯病菌[18]、番茄早疫病菌[19]等病原真菌，番茄青枯病菌[20]等病原細菌均有較好的拮抗作用。目前生防類芽孢桿菌作用機制方面的研究，主要集中在分泌抗菌蛋白（抗菌蛋白、肽類、胞外多糖等）、與病菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)，以及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性等方面[21-23]。CEB33對木薯主要病害病原菌的抑菌作用機理將是筆者們下一步研究工作的重點。

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