HPLC法測(cè)定磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量

章厲劼 王慶紅 金曉峰

摘 要：建立了獸藥磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測(cè)定法。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，流速為1.0mL/min，柱溫40℃，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量?；前穼?duì)甲氧嘧啶的線性范圍0.005～0.10mg/mL，回歸方程為Area=71641.62×Amt+3.01（n=5），相關(guān)系數(shù)大于0.99999?；前穼?duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶三個(gè)添加濃度的添加回收率均均在98.2%～103.0%之間，RSD分別為0.51%、1.1%、0.87%。該方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，穩(wěn)定性，精密度好，回收率高，可以用于測(cè)量磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量。

關(guān)鍵詞：磺胺對(duì)甲氧嘧啶片；磺胺對(duì)甲氧嘧啶；高效液相色譜

Abstract：An HPLC method has been devloped to determine the content of sulfamethoxydiazine in sulfamethoxydiazine Tablets. With eighteen alkyl silane bonded silica as filler， 0.1% phosphoric acid solution - acetonitrile （80：20） as mobile phase. The detection wavelength is 270nm， the flow rate is 1.0mL/min， the column temperature is 40 degrees Celsius， Quantitatively by external standard method. Sulfamethoxydiazine in the linear range of 0.005～0.10 mg/mL， the regression equation is Area=71641.62×Amt+3.01（n=5）， The correlation coefficient is greater than 0.99999. Sulfamethoxydiazine tablets sulfamethoxydiazine add three concentrations were between recoveries were 98.2%～103.0%， and RSD were 0.51%， 1.1%， 0.87%. The method is simple， accurate， stability， precision， high recovery rate， can be used to measure sulfamethoxydiazine Tablets methoxy pyrimidine sulfonamides content.

Key words：sulfamethoxydiazine tablets；sulfamethoxydiazine；HPLC

磺胺對(duì)甲氧嘧啶（C11H12N4O3，簡(jiǎn)稱SMD）作為一種磺胺類(lèi)藥，屬于長(zhǎng)效磺胺?；前穼?duì)甲氧嘧啶用于控制畜禽細(xì)菌性疾病和雞球蟲(chóng)病[ 9 ]，對(duì)革蘭氏陰性菌有效，對(duì)化膿性鏈球菌、肺炎球菌、傷寒桿菌、沙門(mén)氏菌、鼠疫桿菌、和肺炎桿菌均有良好的抗菌作用，常用作飼料添加劑及畜禽疾病的治療和預(yù)防[ 7 ]。

其具有乙酰化率低，毒性和副作用小，主要經(jīng)腎臟排泄等優(yōu)點(diǎn)[ 8 ]。《中華人民共和國(guó)獸藥典》中磺胺對(duì)甲氧嘧啶片[ 1 ]中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量測(cè)定采用的是永停滴定法，但在實(shí)際檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定性差，懷疑可能是制劑中的輔料干擾了電極的感應(yīng)，有些廠家生產(chǎn)的磺胺對(duì)甲氧嘧啶片用永停滴定法根本無(wú)法準(zhǔn)確的檢測(cè)磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量，不能有效進(jìn)行質(zhì)量控制。

本研究建立了磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測(cè)定法，并根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》中“獸藥中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”[ 1 ]對(duì)新建方法的準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、耐用性、穩(wěn)定性及線性等進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器和試藥

Agilent 1260 Infiinity高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）；

ZYT-1全自動(dòng)永停滴定儀（無(wú)錫科達(dá)）；

超聲波清洗器（KQ-300DE，昆明市超聲儀器廠）；

BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；

磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉對(duì)照品（Dr.Ehernstorfer GmbH公司，批號(hào)：10228，含量：99.0%）；

磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料（湖北欣達(dá)利生化有限公司，批號(hào)為：20121001）試驗(yàn)樣品由成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供（批號(hào)：20130101、20130102、20130103，規(guī)格：0.5g）；

乙腈（色譜純）；

水為超純水；其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 藥典方法

《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010年版一部中“磺胺對(duì)甲氧嘧啶片”含量測(cè)定項(xiàng)下方法[ 1 ] 。

2.2 色譜方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm；柱溫：40℃；0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）為流動(dòng)相；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm[ 3 ]；進(jìn)樣體積為20μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉對(duì)照品約54mg（相當(dāng)于含磺胺對(duì)甲氧嘧啶50mg），精密稱定，置50ml量瓶中，加鹽酸10mL，超聲處理（功率250W，頻率20kHz）5分鐘，取出，加水稀釋至刻度。即得濃度為1.0mg /mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取5mL濾液置于100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得50μg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照溶液。

2.2.3 供試樣品處理

取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于磺胺對(duì)甲氧嘧啶0.2g）置200ml量瓶中，加鹽酸10mL，超聲處理（功率250W，頻率20kHz）5分鐘，取出，加水稀釋至刻度。精密量取5mL濾液置于100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 藥典方法

取成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供的批號(hào)為20130101、20130102、20130103的磺胺對(duì)甲氧嘧啶片及湖北欣達(dá)利生化有限公司生產(chǎn)的批號(hào)為20121001的磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥物按2.1項(xiàng)進(jìn)行處理測(cè)定。以測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差RSD表示試驗(yàn)的精密度，RSD分別為8.30%、4.86%、13.96%、0.18%。

可見(jiàn)成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供的磺胺對(duì)甲氧嘧啶片檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性差，偏差較大，而磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥物的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性較好。

原因可能是成藥制劑中某種輔料對(duì)電極的電流造成干擾，使全自動(dòng)永停滴定儀無(wú)法準(zhǔn)確判斷終點(diǎn)，而原料藥物中沒(méi)有這種輔料，所有電極不受干擾，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、偏差小。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 色譜方法

3.2.1線性范圍

精密量取1.0mg /mL磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mL，分別置于100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得含甘草酸濃度分別為0.005、0.01、0.025、0.050、0.10mg/mLmg/mL的對(duì)照溶液系列。注入高效液相色譜儀。

磺胺對(duì)甲氧嘧啶濃度在0.005～0.10mg/mL范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Area=71641.62×Amt+3.01（n=5），相關(guān)系數(shù)大于0.99999，對(duì)照品溶液色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

3.2.2精密度

取成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供的批號(hào)為20130101、20130102、20130103的磺胺對(duì)甲氧嘧啶片各10片，精密稱定，研細(xì)。批號(hào)為20130101稱取6份，批號(hào)為20130102、20130103各取2份，按2.2.3項(xiàng)進(jìn)行處理，每個(gè)樣品進(jìn)樣2針，進(jìn)行含量測(cè)定，以Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm為色譜柱，采用50μg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照溶液進(jìn)行單點(diǎn)定量（除非特別說(shuō)明，均以Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm為色譜柱，用50μg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照溶液進(jìn)行單點(diǎn)定量計(jì)算，下同）。供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖2。RSD分別為0.27%、0.41%、0.16%，表明方法的精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2.3準(zhǔn)確性

稱取湖北欣達(dá)利生化有限公司生產(chǎn)的批號(hào)為20121001的磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥物3份，按2.2.3項(xiàng)進(jìn)行處理，每個(gè)樣品進(jìn)樣2針，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

稱取2.2中研細(xì)的批號(hào)為20130101的磺胺對(duì)甲氧嘧啶片9份，按高（H）、中（M）、低（L）三個(gè)濃度水平分加添加磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥物，每個(gè)濃度添加3份，按2.2.3項(xiàng)進(jìn)行處理，每個(gè)樣品進(jìn)樣2針，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，三個(gè)添加水平的磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率均在98.2%～103.0%之間，RSD分別為0.51%、1.1%、0.87%，方法具有良好的準(zhǔn)確性。

3.2.4耐用性

取2.2項(xiàng)下處理的樣品，保持流動(dòng)相比例不變，使用Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm色譜柱，柱溫：30℃，流速：0.9mL/min下進(jìn)行測(cè)試，磺胺對(duì)甲氧嘧啶片含量分別為98.2%、96.0%、97.8%；使用安捷倫 ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm，柱溫：40℃，流速：1.0mL/min下進(jìn)行測(cè)試，磺胺對(duì)甲氧嘧啶片含量分別為97.2%、95.8%、97.3%。三種色譜條件下測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，說(shuō)明耐用性良好。

3.2.5專屬性

在樣品測(cè)試色譜圖中，標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間附件未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰。取不含磺胺對(duì)甲氧嘧啶的溶液測(cè)定，在磺胺對(duì)甲氧嘧啶的保留時(shí)間，也沒(méi)有對(duì)應(yīng)峰?？梢?jiàn)方法的專屬性良好。

3.2.6穩(wěn)定性

取3.2.2的供試品溶液，放置5天后，再次測(cè)定，磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量分別為97.4%、96.8 %、97.9%，與3.2.2的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明穩(wěn)定性好。

4 討論與結(jié)論

4.1 色譜條件的優(yōu)化

參考其他磺胺類(lèi)藥物的含量測(cè)定、磺胺類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法及相關(guān)文獻(xiàn)雜志，高效液相色譜法測(cè)定磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶所使用的流動(dòng)相系統(tǒng)有磷酸鹽溶液-甲醇（65+35）[ 3 ]、磷酸二氫鉀（0.5mol/L）-磷酸氫二鈉（0.5mol/L）-甲醇（40：40：20）[ 4 ]、0.017 mol/L磷酸-乙腈（80+20）[ 5 ]、0.1%磷酸溶液-乙腈（90∶18） [ 6 ]等。采用流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）時(shí)，配置簡(jiǎn)單，對(duì)色譜柱的柱效損傷小。

磺胺對(duì)甲氧嘧啶的出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形良好，理論塔板數(shù)均也能達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸藥典》[ 1 ]規(guī)定要求。

4.2 樣品處理的優(yōu)化

在進(jìn)行樣品處理的過(guò)程中，分別采用10mL鹽酸、20mL鹽酸、10mL稀鹽酸、10mL 0.4%的NaOH[ 2 ]溶液溶解后，超聲處理5～10min，然后再加水定容。發(fā)現(xiàn)采用10mL鹽酸溶解，可以降低成分制劑中輔料對(duì)磺胺對(duì)甲氧嘧啶的吸附，增強(qiáng)磺胺對(duì)甲氧嘧啶的溶解，從而提高磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率。且供試品溶液不會(huì)因酸度太高而影響到C18柱的柱效與壽命。

4.3 色譜條件的改變

保持流動(dòng)相比例和流速不變，分別在島津LC2010及Agilent 1260 infinity 色譜儀上分別使用菲羅門(mén)Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm色譜柱和ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm色譜柱于30℃及40℃條件下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試，磺胺對(duì)甲氧嘧啶的保留時(shí)間有變化，但檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響?？梢?jiàn)方法適用于不同設(shè)備、不同色譜條件下。

4.4 對(duì)比

3.1和3.2.3分別用永停滴定法及高效液相色譜法對(duì)湖北欣達(dá)利生化有限公司生產(chǎn)的批號(hào)為20121001的磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥物進(jìn)行了含量測(cè)定，含量分別為90.7%和91.3%，兩種方法的結(jié)果偏差為0.33%。可見(jiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果基本一致，也證明了高效液相檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性與可行性。

4.5 建立磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量的高效液相色譜法測(cè)定是可行的

各方法學(xué)指標(biāo)均比較理想，可以作為磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有方法采用永停滴定法測(cè)量磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量，最少操作容易，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，運(yùn)行成本低，但測(cè)定時(shí)無(wú)法與磺胺間甲氧嘧啶區(qū)分，還需要作硫酸銅沉淀的鑒別反應(yīng)來(lái)鑒其真?zhèn)?，且遇到輔料對(duì)電極會(huì)造成干擾的情況時(shí)，是無(wú)法對(duì)磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量的。

在科學(xué)日益進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件及檢測(cè)能力不斷提升的時(shí)代，高效液相色譜法更適合于永停滴定法檢測(cè)磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量。

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