巴西橡膠樹(shù)鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbMGT10的克隆及表達(dá)分析

陽(yáng)江華　秦云霞　方永軍　唐朝榮

摘 要 Mg2+是植物細(xì)胞中含量最高的二價(jià)陽(yáng)離子，是多種酶活性調(diào)控的輔因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用；同時(shí)，作為葉綠素分子的中心原子，在植物光合作用中起著至關(guān)重要的作用，但目前有關(guān)高大喬木葉片中Mg2+跨膜運(yùn)輸?shù)难芯窟€很少。MGT/MRS2類型的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物鎂離子的跨膜運(yùn)輸過(guò)程中起著重要的作用，本文克隆研究了一個(gè)巴西橡膠樹(shù)MGT基因，HbMGT10。亞細(xì)胞定位顯示，HbMGT10定位于葉綠體膜上；酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，HbMGT10具有鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能；qRT-PCR分析結(jié)果顯示，HbMGT10主要在橡膠樹(shù)葉片中表達(dá)，且是葉片中表達(dá)豐度最高的HbMGT基因；HbMGT10在葉片中的表達(dá)存在明顯的發(fā)育調(diào)控，隨葉片發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量明顯增加，在淡綠期和穩(wěn)定期表達(dá)量最大；HbMGT10在成熟葉片中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的日變化，在光強(qiáng)度最大的12 ： 00～16 ： 00的表達(dá)量最大。由此推測(cè)，HbMGT10在橡膠樹(shù)葉片葉綠體膜的鎂離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要的作用，參與了橡膠樹(shù)葉片葉綠體的發(fā)育，以及葉綠體中鎂離子濃度的調(diào)控，以適應(yīng)橡膠樹(shù)葉片的光合作用。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù)；鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；鎂離子；HbMGT10；葉綠體

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Mg2+是植物細(xì)胞質(zhì)中僅次于鉀離子、含量第二的陽(yáng)離子，參與多種生理生化過(guò)程[1]。Mg2+位于葉綠素中央，是植物光合作用的關(guān)鍵陽(yáng)離子，當(dāng)鎂離子缺乏時(shí)，葉綠素濃度降低、光合效率下降，葉片發(fā)黃，產(chǎn)生萎黃病[2]。

高等植物中，鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中在MGT（Magnesium Transporter）/MRS2（Mitochondrial RNA Splicing2）鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3-4]和一種質(zhì)子依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mg2+/H+交換體[5-6]。其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和離子通道也具有一定的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，比如大豆的SV通道[7]，水稻的OsHKT2；4[8]，擬南芥的AtCNGC10[9]。MGT/MSR2類型的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是基因數(shù)量最多的，目前研究最廣泛的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族，位于植物細(xì)胞的細(xì)胞膜和液泡膜、葉綠體膜、線粒體膜等亞細(xì)胞器膜上，在維持細(xì)胞質(zhì)和亞細(xì)胞器Mg2+濃度動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用[3-4，10-11]。通過(guò)研究擬南芥突變體，發(fā)現(xiàn)AtMGT有著多種不同的功能。在蛇紋巖土中培養(yǎng)時(shí)，atmgt2和atmgt3突變體葉肉細(xì)胞中的Mg2+濃度明顯低于野生型植株[12]。AtMGT5定位于線粒體上，在雄配子的細(xì)胞質(zhì)和線粒體間的Mg2+運(yùn)輸過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，atmgt5突變體的雄配子發(fā)育存在缺陷，不能獲得AtMGT5突變體的純合子[13]。當(dāng)Mg2+濃度低至50 μmol/L時(shí)，mrs2-7（atmgt7）突變體的生長(zhǎng)受到明顯抑制，而在突變體中過(guò)表達(dá)atmrs2-7（AtMGT7）后植株的生長(zhǎng)速度恢復(fù)到野生型的水平[14]。AtMGT9主要在成熟花藥和維管組織中表達(dá)，在雄配子發(fā)育和雄性育性上起著關(guān)鍵的作用；AtMGT9基因T-DNA插入雜合體突變體擬南芥+/mgt9中，有一半的突變體植株花粉敗育，且突變體自交不能產(chǎn)生同樣的雜合體+/mgt9子代[15]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtMRS2-11（AtMGT10）基因，雖然會(huì)增加AtMRS2-11的蛋白表達(dá)水平，但未產(chǎn)生可觀察到的表型變化[17]。

目前，MGT/CoA鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中在模式植物擬南芥，以及糧食作物水稻和玉米等草本植物中[3-4，10，16]，在高大喬木中的研究報(bào)道很少。巴西橡膠樹(shù)是一種來(lái)源于巴西熱帶雨林的高大喬木，其葉片中鎂離子的運(yùn)輸可能有其自身獨(dú)特的特點(diǎn)。前期研究中，已從橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)中獲得了11個(gè)鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（HbMGTs）（未發(fā)表文獻(xiàn)）。本研究成功克隆了主要在葉片中表達(dá)的HbMGT10基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行了相關(guān)功能研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用樹(shù)為巴西橡膠樹(shù)，品系為熱研7-33-97，采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)3隊(duì)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和菌種 克隆載體pMD-18T載體為大連寶生物公司產(chǎn)品，DNA Polymerase High Fidelity和熒光定量試劑為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DNA限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4 DNA連接酶為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品。通用植物總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。大腸桿菌菌種DH5α，釀酒酵母菌種SEY6210（MATα leu2-3，112 ura3-52 hisΔ200 trp-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9），酵母表達(dá)載體pDR196和pGBKT7，亞細(xì)胞定位載體HBT95-sGFPS65T-NOS，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成和DNA測(cè)序均由上海英俊生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 不同組織和器官的實(shí)驗(yàn)材料采自10年生、開(kāi)割3 a的未進(jìn)行乙烯利刺激割膠的橡膠樹(shù)。同一天不同時(shí)間點(diǎn)的葉片，以及不同發(fā)育時(shí)期的葉片，采自定植4 a的幼齡樹(shù)。3株橡膠樹(shù)為1個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，共3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 巴西橡膠樹(shù)膠乳總RNA的提取參照Tang等[18]的辦法。除膠乳外其它材料的總RNA提取使用百泰克公司的通用植物總RNA提取試劑盒，使用方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。cDNA第一鏈的合成使用Thermo Fisher公司的cDNA第一鏈合成試劑盒，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 HbMGT10基因的克隆 以擬南芥的AtMRS2-11（AtMGT10）[17]的氨基酸序列為搜索序列，通過(guò)搜索巴西橡膠樹(shù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，拼接得到HbMGT10的cDNA序列。以葉片cDNA為模板，使用引物HbMGT10-F和HbMGT10-R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，連接到pMD-18T載體中，陽(yáng)性克隆送上海英俊生物技術(shù)公司測(cè)序。最終得到HbMGT10的全長(zhǎng)cDNA序列。所用引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析HbMGT10基因在不同組織、葉片不同發(fā)育時(shí)期、葉片一天內(nèi)不同時(shí)間的表達(dá)變化。不同組織和葉片不同發(fā)育分析時(shí)使用的內(nèi)參基因是RH2b，葉片一天不同時(shí)間點(diǎn)分析時(shí)使用的內(nèi)參基因?yàn)閁BC2a，內(nèi)參基因的引物序列和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法參照Li等的論文[19]。

1.2.5 酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析 酵母菌種SEY6210為野生菌種，線粒體膜上有ScMRS2基因，能夠有效利用甘油等非發(fā)酵碳源，維持正常生長(zhǎng)。以pGBKT7質(zhì)粒為模板，兩端分別帶有ScMRS2基因同源臂的引物mrs2-Trp-F和mrs2-Trp-R，擴(kuò)增TRP1基因，通過(guò)同源重組的方法[20]，以TRP1基因替換掉ScMRS2基因，這樣SEY6210能夠在Trp缺陷型酵母培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。成功敲除了ScMRS2基因，獲得的突變體酵母SEY-mrs2不能在只添加非發(fā)酵碳源的YPdG培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但在添加發(fā)酵碳源的YPD培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)。YPdG培養(yǎng)基配方為：1% Yeast Extract，2% Peptone，3%甘油，0.05%葡萄糖，2%瓊脂粉。YPD培養(yǎng)基配方：1% Yeast Extract，2% Peptone，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。

為了使得HbMGT10能夠準(zhǔn)確定位到酵母的線粒體內(nèi)膜上，以互補(bǔ)ScMRS2的功能。用引物對(duì)ScMRS2-pro和ScMsr2+95AA擴(kuò)增酵母ScMRS2的啟動(dòng)子和前95個(gè)氨基酸，連接到pDR196載體。使用引物對(duì)HbMGT10-143aa和HbMGT10-Pst擴(kuò)增除去了前5'端143個(gè)氨基酸的HbMGT10，再連接到ScMRS2的第95個(gè)氨基酸后，組成了一個(gè)ScMRS2和HbMGT10的融合蛋白。構(gòu)建完成的HbMGT10酵母表達(dá)載體196-HbMGT10轉(zhuǎn)化突變體酵母SEY-mrs2，分別在YPdG和YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。使用同樣的方法，構(gòu)建了去除5′端107個(gè)氨基酸的HbMGT6的酵母表達(dá)載體196-HbMGT6。

1.2.6 亞細(xì)胞定位分析 使用引物對(duì)HbMGT10-SF和HbMGT10-SR擴(kuò)增HbMGT10基因的去除了終止密碼子TAA的編碼區(qū)。然后連接到HBT95-sGFPS65T-NOS載體的綠色熒光蛋白基因GFP的前面，構(gòu)建HbMGT10的亞細(xì)胞定位分析載體HBT-HbMGT10。HbMGT10的亞細(xì)胞定位分析使用水稻原生質(zhì)體，方法參照Chen等[21]，略有改動(dòng)。其中GFP綠色熒光使用的激發(fā)光波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510 nm，葉綠體自發(fā)紅光的激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為650 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbMGT10基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

通過(guò)RT-PCR獲得了HbMGT10的全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)1 757 bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)1 329 bp，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)99 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)329 bp，編碼442個(gè)氨基酸序列。與擬南芥定位于葉片葉綠體的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtMRS2-11[17]的氨基酸序列同源性為71.3%。ChloroP 1.1預(yù)測(cè)HbMGT10定位于葉綠體，信號(hào)肽長(zhǎng)53個(gè)氨基酸。

2.2 HbMGT10基因的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，HbMGT10基因主要在巴西橡膠樹(shù)的葉片中表達(dá)，花中次之，膠乳和種子的表達(dá)量極低，尚不足葉片表達(dá)量的百分之一（圖1）。利用巴西橡膠樹(shù)的Solexa高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析橡膠樹(shù)HbMGT家族全部11個(gè)基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果表明，HbMGT10在葉片中的表達(dá)豐度顯著高于其它10個(gè)家族基因，是橡膠樹(shù)葉片中表達(dá)豐度最高的HbMGT基因（圖2）。分析巴西橡膠樹(shù)不同發(fā)育時(shí)期葉片中HbMGT10的表達(dá)水平，結(jié)果表明該基因隨葉片發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量不斷增加，在淡綠和穩(wěn)定期葉片中表達(dá)量最高（圖3）。在同一天不同時(shí)間點(diǎn)葉片中的表達(dá)分析表明，HbMGT10在光強(qiáng)度大的12 ： 00～16 ： 00期間的表達(dá)量最大（圖4）。

2.3 HbMGT10酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

ScMRS2是酵母線粒體中II類內(nèi)含子自我剪接缺陷的抑制基因，定位于線粒體內(nèi)膜上，也參與了線粒體鎂離子的跨膜運(yùn)輸，ScMRS2的缺失會(huì)造成酵母不能在非發(fā)酵碳源的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)[22-23]。本研究成功獲得了敲除ScMRS2基因的酵母突變體SEY-mrs2，該突變體不能在添加非發(fā)酵碳源的YPdG培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)（圖5），表達(dá)了HbMGT10的SEY-mrs2的生長(zhǎng)明顯好于SEY-mrs2，但仍比野生型酵母差，表明HbMGT10能夠部分互補(bǔ)ScMRS2的功能，而HbMGT6則完全不能互補(bǔ)ScMRS2的功能。

2.4 HbMGT10的亞細(xì)胞定位分析

HbMGT10-GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后暗培養(yǎng)24～48 h，使用激光共聚焦顯微鏡Olympus FV1000觀察轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果表明，HbMGT10-GFP融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中激發(fā)的綠色熒光和原生質(zhì)體葉綠體的自發(fā)紅光大部分能夠重疊在一起，產(chǎn)生黃色熒光，說(shuō)明HbMGT10定位于葉綠體上（圖6）。

3 討論與結(jié)論

Mg2+是葉綠素的中心原子，Mg2+的缺乏，會(huì)造成葉片中淀粉和蔗糖的過(guò)度積累，產(chǎn)生萎黃病[11]。同時(shí)，地上部分比根更容易受到鎂缺乏的影響，擬南芥的28Mg同位素示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，鎂離子主要集中在地上部分較低的位置，難以到達(dá)地上部分的頂端[11，24-25]。鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在植物葉片Mg2+的跨膜運(yùn)輸和維持葉片Mg2+濃度的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

MGT/MSR2基因家族編碼有功能的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在擬南芥中有10個(gè)基因[3-4]，水稻中有9個(gè)[10]，玉米中有12個(gè)[16]。前期研究發(fā)現(xiàn)巴西橡膠樹(shù)中有11個(gè)MGT/MRS2基因（未發(fā)表文獻(xiàn)）。本結(jié)果顯示這些HbMGT基因都在橡膠樹(shù)葉片中有表達(dá)，其中HbMGT10是葉片主要表達(dá)的HbMGT基因。酵母突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示HbMGT10是一個(gè)有功能的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能夠部分互補(bǔ)敲除了ScMRS2基因的酵母突變體SEY-mrs2；亞細(xì)胞定位顯示，HbMGT10定于葉綠體上，可能參與了橡膠樹(shù)葉綠體中鎂離子的跨膜運(yùn)輸。表達(dá)分析結(jié)果表明，HbMGT10主要在橡膠樹(shù)成熟期的葉片中表達(dá)，而且在一天中光照最強(qiáng)的12 ： 00～16 ： 00的表達(dá)量最強(qiáng)，是晚上和凌晨表達(dá)量的3倍，而擬南芥光照4和8 h后，AtMRS2-11基因的表達(dá)量是夜晚表達(dá)量的2倍[17]，HbMGT10基因和擬南芥AtMRS2-11基因一樣，其表達(dá)受到光的調(diào)控。用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)[26]分析HbMGT10基因的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其含有多個(gè)光調(diào)控的順式作用元件。研究說(shuō)明HbMGT10在巴西橡膠樹(shù)葉片中葉綠體的Mg2+跨膜運(yùn)輸起著重要作用，還可能參與了葉綠體的發(fā)育，以及葉綠體不同光照強(qiáng)度下Mg2+濃度的調(diào)控，以適應(yīng)葉片不同的光合作用強(qiáng)度。

本研究首次從巴西橡膠樹(shù)中克隆了在葉片中主要表達(dá)的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbMGT10，通過(guò)酵母互補(bǔ)和亞細(xì)胞定位分析明確其編碼一個(gè)有功能的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并從組織特異性、葉片發(fā)育階段和日變化等方面研究了該基因的表達(dá)特性，為深入揭示其生理功能奠定了良好基礎(chǔ)。

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