牧草葉綠體基因組研究進(jìn)展

陶曉麗，王彥榮，劉志鵬

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

牧草葉綠體基因組研究進(jìn)展

陶曉麗，王彥榮，劉志鵬

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

葉綠體是植物能量轉(zhuǎn)化和光合作用的重要細(xì)胞器，也是母本遺傳信息的重要載體。葉綠體基因組信息在揭示物種進(jìn)化、雜交、演變，以及物種鑒定等方面具有重要價(jià)值。在其他植物葉綠體基因組研究迅速發(fā)展的同時(shí)，牧草葉綠體基因組的研究也緊隨其后，但針對(duì)部分牧草的研究并未深入進(jìn)行，僅僅是完成了葉綠體基因組全序列的測(cè)定。鑒于牧草葉綠體基因組研究的重要性，本文收集整理了近年來(lái)的有關(guān)資料，從葉綠體DNA的分離、提純、測(cè)序以及牧草葉綠體基因組的研究進(jìn)展等幾個(gè)方面歸納了此領(lǐng)域的最新研究成果，旨在使人們進(jìn)一步了解葉綠體DNA的提純以及牧草葉綠體基因組的研究現(xiàn)狀、今后的發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景。

牧草；葉綠體；基因組；純化；測(cè)序

葉綠體是光合作用的主要場(chǎng)所，是植物細(xì)胞內(nèi)具有自主遺傳信息的半自主性細(xì)胞器，它普遍存在于陸生植物、大多數(shù)藻類和部分原生生物中[1]。近年來(lái)，利用分子生物學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建生物類群的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)不斷被運(yùn)用[2]，分子系統(tǒng)學(xué)研究也在不斷發(fā)展。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)對(duì)于復(fù)雜龐大的核基因組而言，僅僅通過(guò)比較個(gè)別基因的遺傳變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而且個(gè)別序列在分析物種的地理起源與其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系方面仍存在些許疑問(wèn)[3]，所以人們開(kāi)始尋找其他的切入點(diǎn)去解決這些疑問(wèn)。如Correns[4]1909年通過(guò)遺傳學(xué)分析紫茉莉(Mirabilisjalapa)的葉斑現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了與葉綠體結(jié)構(gòu)和發(fā)育有關(guān)的遺傳因子，而這些現(xiàn)象卻不符合孟德?tīng)柖?。Ris和Plaut[5]1962年通過(guò)對(duì)衣藻(Chlamydomonassp.)葉綠體的研究，發(fā)現(xiàn)了DNA纖絲。此后，葉綠體DNA在很多植物中先后被發(fā)現(xiàn)，并引起了研究人員的高度關(guān)注。

由于葉綠體是光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的重要細(xì)胞器，而光合作用嚴(yán)格受遺傳控制，因而了解葉綠體基因組各部分的功能以及葉綠體在生物進(jìn)化中的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系及作用，對(duì)今后深入研究作物改良、提高光合效率、探索細(xì)胞器的起源和進(jìn)化，從而充分發(fā)揮葉綠體功能具有重要意義[6]，而全面分析葉綠體基因組序列是做好這些工作的前提。由于現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)葉綠體基因組的研究日益深入。葉綠體基因組研究不僅有助于通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化體系改良葉綠體功能，選育出有價(jià)值的新品種，而且可以在分子水平上揭示光合作用機(jī)理、核質(zhì)互作關(guān)系以及物種起源與進(jìn)化[7]。1986年Shinozaki等[8]獲得煙草(Nicotianatabacum)葉綠體基因組全序列，開(kāi)啟了葉綠體基因組測(cè)序的先河，同年，Ohyama等[9]又測(cè)得地錢(Marchantiapolymorpha)葉綠體基因組的完整序列，發(fā)展至今，葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)正在迅速充實(shí)。2005年，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)細(xì)胞器基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了超過(guò)160種植物的葉綠體基因組全序列，除此之外還有很多植物的葉綠體DNA(cpDNA)全序列的測(cè)定正在進(jìn)行[10]。到2012年3月NCBI中收集了來(lái)自不同植物的269條葉綠體基因組全序列[11]，截至2015年2月，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集了579條植物的葉綠體基因組的全序列，以及一些植物的部分葉綠體基因組或某些基因的序列，其中包含同一個(gè)種的不同亞種和同一種的不同栽培品種的葉綠體基因組全序列，例如水稻(Oryzasativa)就有3個(gè)亞種，包括野生稻(O.nivara)[12]、秈稻(O.sativasubsp.indica)[13]和粳稻(O.sativasubsp.japanica)[14]，而西爾斯山羊草(Aegilopssearsii)有TA1841、TA1837和TA1926三個(gè)栽培品種且都已測(cè)序完成。然而，關(guān)于牧草葉綠體基因組的研究卻不多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中記載了40種牧草葉綠體基因組全序列，以及一些牧草栽培品種的葉綠體基因組全序列，而有文獻(xiàn)報(bào)道的牧草葉綠體基因組全序列研究的僅有二十幾種，僅是基因庫(kù)中所記載全序列的一半左右。即有些牧草雖然進(jìn)行了葉綠體基因組全序列的測(cè)序，但未曾對(duì)其進(jìn)行深入研究。因此，本文以前人對(duì)牧草葉綠體基因組的研究為前提，搜集整理了此領(lǐng)域的最新成果，并結(jié)合葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和功能，簡(jiǎn)要總結(jié)了牧草葉綠體基因組的測(cè)序方法及研究進(jìn)展，旨在使人們進(jìn)一步了解牧草葉綠體基因組目前的研究現(xiàn)狀、今后的發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景。

1 葉綠體基因組全序列的測(cè)定

全基因組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)每個(gè)生物個(gè)體來(lái)說(shuō)都具有里程碑的意義。而葉綠體基因組全序列的測(cè)定更是一項(xiàng)細(xì)致且復(fù)雜的工作，作為一項(xiàng)精細(xì)技術(shù)，對(duì)所提取的葉綠體 DNA(cpDNA)的含量及純度都有很高的要求[15]。所以要獲得較高質(zhì)量的植物葉綠體DNA全序列，試驗(yàn)設(shè)計(jì)尤為重要。近年來(lái)被子植物包括牧草葉綠體DNA全序列的測(cè)定所采用的試驗(yàn)方案主要有以下3種：1)提取并純化植物葉綠體DNA，再將其隨機(jī)剪切，鳥(niǎo)槍法克隆，最后測(cè)序，這也是最基本的測(cè)序方法，但這種試驗(yàn)方案耗時(shí)、費(fèi)力，成本高，而且容易丟失片段，故現(xiàn)在已很少采用；2)提取植物葉綠體DNA，通過(guò)Long-PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆(連接)到載體上，最后測(cè)序，這種方案是繼第1種方案后使用比較快捷的試驗(yàn)方案；3)Fosmid文庫(kù)構(gòu)建，按照f(shuō)osmid文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Fosmid Library Production Kit)說(shuō)明進(jìn)行操作。目前普遍采用的是第3種實(shí)驗(yàn)方案，同時(shí)將其與Long-PCR技術(shù)配合使用，使測(cè)序工作更加順利[15]。

1.1 葉綠體DNA的分離和提純

自1979年Kolondener和Tewari[16]首次從高等植物豌豆(Pisumsativum)獲得葉綠體DNA以來(lái)，高等植物的葉綠體DNA被抽提并被廣泛研究，尤以豆科和禾本科葉綠體DNA研究較多。一般來(lái)說(shuō)，由于葉綠體DNA含量太少，而且有諸多外源因素(如，核DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)的干擾，葉綠體DNA的提取很難，而要獲得純度較高、濃度較大的葉綠體DNA更是難上加難。為了進(jìn)一步研究葉綠體DNA的功能及與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，人們發(fā)明了一系列高等植物葉綠體DNA的提取方法，最經(jīng)典的方法有DNase I法[16]、蔗糖梯度離心法[17]、Percoll梯度法[17]、氯化銫梯度離心法[18]，但這幾種方法耗時(shí)、費(fèi)力，對(duì)儀器的要求很高，而且提取的葉綠體DNA的濃度及純度也不是很高。除此之外，還有無(wú)水法和高低鹽pH法[19]等。后來(lái)，專家們通過(guò)幾種方法的結(jié)合，發(fā)明了幾種更為高效地提取植物葉綠體DNA的方法，如趙衍和翁醒華[20]在提取水稻葉綠體DNA時(shí)，通過(guò)蔗糖梯度離心法與調(diào)節(jié)pH來(lái)改變細(xì)胞表面的帶電量的方法相結(jié)合，快速有效地提取葉綠體DNA；再者，龔小松和閻隆飛[21]在提取高粱葉綠體DNA時(shí)，將pH法與高鹽緩沖相結(jié)合，同樣有效地提取了葉綠體DNA。雖然提純方法不同，但這些方法大都包含了3個(gè)最基本的步驟：質(zhì)體的分離，葉綠體的裂解和葉綠體DNA的純化，以達(dá)到提純的目的。而在提純中所面臨的共同問(wèn)題表現(xiàn)在：1)提取足夠的葉綠體；2)裂解和釋放葉綠體DNA。而由于核DNA依附在葉綠體表面，導(dǎo)致葉綠體分離困難。所以，不同的提純方法只是在葉綠體顆粒純化和葉綠體DNA的裂解和釋放時(shí)所做的處理不同而已。

1.2 葉綠體DNA全序列的測(cè)定和組裝

DNA測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要手段之一。植物遺傳信息快速準(zhǔn)確的獲得對(duì)生命科學(xué)研究具有重要意義。對(duì)于每個(gè)物種來(lái)說(shuō)，基因組測(cè)序能夠真實(shí)的反映基因組DNA上的遺傳信息，通過(guò)與不同個(gè)體或群體的比對(duì)，進(jìn)而比較全面的揭示基因組(包括核基因組和質(zhì)體基因組)的復(fù)雜性和多樣性，所以基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展對(duì)生命科學(xué)研究中具有里程碑的意義。從1977年Sanger等[22]報(bào)道的雙脫氧鏈終止序列測(cè)定法，到高通量測(cè)序?yàn)榇淼牡诙夹g(shù)，最后到以單分子測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的新一代測(cè)序技術(shù)(第三代測(cè)序技術(shù))，無(wú)一不是測(cè)序技術(shù)的革命性跨越。而目前，市場(chǎng)上最常用的還是高通量為代表的第二代測(cè)序技術(shù)。

測(cè)序之后的組裝也是葉綠體基因組研究的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。葉綠體因其龐大的基因容量使得無(wú)法一次性完成全序列的測(cè)定(現(xiàn)在的單分子測(cè)序可能是一個(gè)新的亮點(diǎn))。全序列的組裝有兩種方法：首先，如果是已知物種葉綠體基因組序列重測(cè)序，可以用MAQ進(jìn)行組裝(Map to Reference Genome)；另外，如果是對(duì)新物種進(jìn)行從頭(De Novo)測(cè)序，即用生物信息學(xué)的方法對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行拼接、組裝[velvet軟件進(jìn)行組裝(De Novo Assembly)]，從而獲得該物種的基因序列圖譜，不需要任何序列信息即可對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行測(cè)序。

2 牧草葉綠體基因組

2.1 概述

現(xiàn)代生物技術(shù)空前發(fā)展，測(cè)序技術(shù)日益完善, 隨之而來(lái)的是越來(lái)越多的葉綠體基因組序列得到解析。然而關(guān)于牧草葉綠體基因組的研究卻很少。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中記載了40種牧草葉綠體全基因組的全序列，從NCBI的Genbank中記載的牧草葉綠體基因組的數(shù)量和物種數(shù)目來(lái)看，牧草在葉綠體基因組的研究方面還不甚深入，而且有些牧草也僅限于葉綠體基因組全序列的測(cè)定，并未進(jìn)行深入分析，可見(jiàn)牧草葉綠體基因組研究領(lǐng)域還具有很大的發(fā)展空間。

2017年11月，國(guó)家13個(gè)部門聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于加強(qiáng)船用低硫燃油供應(yīng)保障和聯(lián)合監(jiān)管的指導(dǎo)意見(jiàn)》，引導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)、銷售、使用合規(guī)的船用低硫燃油，著力解決合規(guī)燃油供應(yīng)不足、市場(chǎng)秩序混亂等突出問(wèn)題，同步推進(jìn)制度建設(shè)和聯(lián)合監(jiān)管。

葉綠體基因組所含有的遺傳物質(zhì)的總和稱為葉綠體基因組(Plastome)。葉綠體DNA(cpDNA)一般為雙鏈環(huán)狀分子，但也有個(gè)別物種為線狀，如傘藻屬(Acetabularia)植物。對(duì)于一個(gè)植物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，一般在細(xì)胞中包含400～1 600個(gè)葉綠體基因組拷貝[23]。通過(guò)基因定位和基因測(cè)序證實(shí)被子植物質(zhì)體基因組通常是非常保守的，大多數(shù)高等植物(包括牧草)葉綠體基因組是高度保守的四分體結(jié)構(gòu)[10]：一個(gè)大的單拷貝區(qū)域(Large Single Copy，LSC)和一個(gè)小的單拷貝區(qū)域(Small Single Copy，SSC)，中間被一對(duì)反向重復(fù)序列(Inverted Reapet Sequence，IR)IRa和IRb所分開(kāi)。對(duì)于一對(duì)反向重復(fù)序列，所含基因序列完全相同，但排列方向相反。也有少數(shù)植物如三葉草(Trifoliumsubterraneum)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)等豆科牧草，因一個(gè)反向重復(fù)序列(IR)完全丟失而具有特殊的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)[24]。牧草葉綠體基因組大小在120～170 kb，基因組通常包括120～130個(gè)基因，其基因容量和基因順序非常保守。Jansen等[25]2008年報(bào)道了鷹嘴豆的葉綠體基因組大小為125 kb，葉綠體基因組大小變異主要受反向重復(fù)區(qū)長(zhǎng)度變異影響。 葉綠體基因組編碼的基因主要分為3類：第1類是與葉綠體基因表達(dá)有關(guān)的基因(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、編碼葉綠體RNA聚合酶的3個(gè)亞基等)；第2類是與光合作用有關(guān)的基因； 第3類包括NADH脫氫酶基因、ORF以及帶有內(nèi)含子的讀碼結(jié)構(gòu)IRF，但它們的功能目前尚不可知[26]。

2.2 禾本科牧草葉綠體基因組

禾本科牧草又稱禾草，是牧草的一個(gè)主要類群，也是天然草原的優(yōu)勢(shì)植物，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和維持草原生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。由于禾草在畜牧業(yè)和生態(tài)上的重要性，引起了一些生物學(xué)家的極大關(guān)注。但由于禾草數(shù)量龐大，而經(jīng)過(guò)深入研究的僅僅是其中的一小部分，經(jīng)過(guò)基因庫(kù)中收錄的19種禾草葉綠體基因組全序列分析，發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)記載禾草葉綠體基因組全序列研究的僅有9種(表1)。與其他植物相比，禾本科植物葉綠體基因組在進(jìn)化過(guò)程中速度加快[32]，并發(fā)生了一系列結(jié)構(gòu)上的變化[33]，因此，禾草葉綠體基因組的研究為整個(gè)葉綠體基因組進(jìn)化研究提供了很好的研究體系。

在禾草的研究中，通過(guò)Southern雜交和PCR分析發(fā)現(xiàn)，禾草葉綠體基因組結(jié)構(gòu)上發(fā)生了變化。首先是基因數(shù)量的變化。禾本科植物葉綠體基因組的基因數(shù)目、內(nèi)含子數(shù)目以及基因排列順序，除了有少數(shù)不同外，表現(xiàn)得十分保守。并且，與香蒲(Typhaorientalis)、煙草等其他科植物葉綠體基因組相比，禾本科物種中accD、ycf1、ycf2基因逐漸退化缺失，通過(guò)羊茅(Festucaovina)和黑麥草(Loliumperenne)比較發(fā)現(xiàn)，羊茅葉綠體基因組中缺失了rps14和ycf4基因，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)造成突變的原因是配對(duì)序列中發(fā)生了多次非三倍數(shù)堿基的插入、缺失，造成移碼突變，進(jìn)而造成基因的丟失[34]；其次是內(nèi)含子的丟失情況。有些物種還會(huì)發(fā)生內(nèi)含子丟失的情況，如禾本科植物最初分化產(chǎn)生的物種發(fā)生clpP基因內(nèi)含子的丟失，隨后又發(fā)生了rpoC1內(nèi)含子丟失[31]；再次，基因排列順序也發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，與煙草、香蒲等其他科物種相比，禾本科植物葉綠體基因組基因的排列順序發(fā)生了3次倒置，而相比較其他物種卻不曾發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象[14]；最后，IR序列邊緣的變化[35]。禾本科植物葉綠體基因組的IR邊緣，即IR和SSC/LSC的邊界發(fā)生變化。禾草葉綠體基因組具有一對(duì)反向重復(fù)區(qū)域IR(IRa和IRb)，IR與兩個(gè)單拷貝區(qū)域(LSC和SSC)之間存在4個(gè)邊界，即IRa/LSC、IRa/SSC、IRb/LSC和IRb/SSC(圖1)。在進(jìn)化過(guò)程中，基因組的IR邊界不斷收縮與擴(kuò)張，致使有些基因進(jìn)入單拷貝序列而有些基因則進(jìn)入IR區(qū)域。每個(gè)物種在邊界處序列復(fù)制的程度也不同。而且禾草葉綠體基因上ndhH和ndhF基因所在的位置有所變化[28]。除此之外，禾本科植物葉綠體基因組的研究還涉及了葉綠體基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)研究，這個(gè)研究已經(jīng)在黑麥草上得以驗(yàn)證[29]。

2.3 豆科牧草葉綠體基因組

豆科牧草是牧草的主要來(lái)源之一，且蛋白質(zhì)含量屬牧草之最，鑒于其重要性和特殊性，豆科牧草的葉綠體基因組研究受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。然而究其研究的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)深入到葉綠體基因組水平的豆科牧草僅僅是冰山一角，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，基因庫(kù)中收錄的豆科牧草葉綠體基因組全序列有16種(表2)，且大部分為車軸草屬(Trifolium)植物。雖然研究種類甚少，但人們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)在進(jìn)化過(guò)程中，豆科牧草葉綠體基因組也發(fā)生了一系列結(jié)構(gòu)上的變化，因此，豆科牧草為其他牧草葉綠體基因組進(jìn)化研究提供了很好的系統(tǒng)。

豆科牧草與禾本科牧草分屬不同的科。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)上的變化也有所不同。第一，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)不同。與禾本科牧草不同的是豆科牧草研究中出現(xiàn)因一個(gè)反向重復(fù)區(qū)完全丟失而具有特殊的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)，如三葉草、蒺藜苜蓿和鷹嘴豆[25]；第二，基因的轉(zhuǎn)移和丟失。在被子植物葉綠體基因組研究中發(fā)現(xiàn)，accD，rpl23，rpl22，ycf1，ycf2，rps16，ycf4和infA等基因都部分或全部從豆科植物的葉綠體基因組缺失，有的基因(如infA)甚至還發(fā)生了多次缺失事件[40]；第三，葉綠體基因組基因的排列順序發(fā)生了倒置。在豆科植物葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)大約50 kb[41-42]和78 kb[43]長(zhǎng)度片段的倒置；第四，基因內(nèi)含子的缺失情況。研究發(fā)現(xiàn)豆科植物葉綠體基因組中，clpP和rps12基因內(nèi)含子發(fā)生了缺失的情況;第五，豆科植物葉綠體DNA上發(fā)生了多次重排[44]；第六，豆科牧草葉綠體基因組出現(xiàn)了RNA編輯現(xiàn)象，如百脈根(Lotusjaponicus)[40]。

表1 禾本科牧草的葉綠體基因組全序列及GenBank號(hào)

注：“來(lái)源”一欄中部分序列研究文章已發(fā)表，部分序列僅由作者提供，沒(méi)有發(fā)表文章。下同。

Note:“Sources”section of the column sequence of research articles have been published, only partial sequence provided by the author, but the article was not published. The same below.

圖1 一般葉綠體[1]和特殊葉綠體基因組(豆科)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Gene schematic diagram of general[1] and special chloroplast genome(Legumes)

注：圖中LSC代表葉綠體結(jié)構(gòu)中大的單拷貝區(qū)域，SSC代表小的單拷貝區(qū)域，A圖中IRA和IRB分別表示反向重復(fù)序列的兩個(gè)片段，其序列完全相同，但排列方向相反；B圖中IR也代表反向重復(fù)序列，但一些植物中一條反向重復(fù)序列丟失。

Note: LSC means a large simple copy and SSC means a small simple copy of the chloroplast structure in the
Fig. Both of IRA and IRB are two invert repeat sequences. there are the same sequence, but difference directions in the
Fig.A. IR is the only of invert repeat sequence, because of disappearing of another of some plants in the
Fig.B.

表2 豆科牧草的葉綠體基因組全序列及GenBank號(hào)

注：“Trifoliumboissieri”和“Trifoliummeduseum”兩個(gè)物種，只在NCBI上有記載，沒(méi)有明確的中文名稱。

Note: The two species, “Trifoliumboissieri” and “Trifoliummeduseum”, were merely recorded in NCBI, not named specifically with Chinese.

2.4 其他科牧草葉綠體基因組測(cè)序

相對(duì)禾草和豆科牧草，其他科牧草則起到了輔助作用，而且這些牧草大部分來(lái)源于野生植物。關(guān)于野生牧草的研究并不多，只有少數(shù)幾個(gè)物種獲得其葉綠體基因組全序列，如菊科的冷蒿(Artemisiafrigida)、蒙大納蒿(A.montana)、矢車菊(Centaureadiffusa)，報(bào)春花科的虎尾菜(Penthorumchinense)以及唇形科的牛至(Origanumvulgare)(表3)。

表3 其他科牧草葉綠體基因組全序列及GenBank號(hào)

研究表明，葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)變化可以解決被子植物的主要分化枝以及很多科植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[30]。由于來(lái)自不同的進(jìn)化枝，所以，不同科的植物其葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)變化也不一樣，如菊科[48]、豆科[36]、禾本科[29]等。但是，不論對(duì)于哪一科、屬的植物，研究方法是一致的，都會(huì)涉及葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)變化，基因的轉(zhuǎn)移和丟失，葉綠體基因組基因的排列順序的變化，是否發(fā)生倒置，基因內(nèi)含子的缺失情況以及葉綠體DNA上是否發(fā)生重排等等一系列的問(wèn)題。

對(duì)于作為新興產(chǎn)業(yè)的草業(yè)，無(wú)論是草坪還是牧草，無(wú)論是栽培牧草還是天然牧草，其重要性不言而喻，所以牧草葉綠體基因組研究無(wú)疑會(huì)在這一領(lǐng)域創(chuàng)造出新的輝煌。對(duì)其葉綠體基因組的研究，也將不僅僅局限于測(cè)序，而是在葉綠體基因組的基因功能、核質(zhì)互作關(guān)系以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等方面做深入研究。每一個(gè)經(jīng)過(guò)葉綠體基因組研究的物種都可以作為一個(gè)參考樣本，為將來(lái)的牧草研究導(dǎo)航。

3 展望

雖然葉綠體基因組的研究在迅速發(fā)展，而且基因庫(kù)中葉綠體基因組全序列的數(shù)據(jù)也在近幾年迅速充實(shí)，但由于龐大的物種數(shù)量，而目前數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的僅僅是其中很小的一部分，且對(duì)于牧草葉綠體基因組研究而言，更是微乎其微，所以牧草葉綠體基因組的全序列有待充實(shí)。然而，對(duì)于已經(jīng)測(cè)序成功的牧草，其大部分仍然停留在葉綠體基因組全序列的完成和提供，并未進(jìn)行深入研究。所以學(xué)者們以及研究人員需要對(duì)其序列進(jìn)行整合分析，研究葉綠體基因組的基因功能、核質(zhì)互作關(guān)系以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為社會(huì)生產(chǎn)實(shí)踐做貢獻(xiàn)。這是目前亟待需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

由于植物葉綠體基因組高拷貝數(shù)(拷貝數(shù)高的可達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè))、高保守性的特點(diǎn)，且在IR區(qū)域的基因出現(xiàn)加倍現(xiàn)象，因此葉綠體基因組相對(duì)于復(fù)雜龐大的核基因組更具有特點(diǎn)。Daniell等[49]、Grevich和Daniell[50]的研究表明植物葉綠體中表達(dá)的目的蛋白占可溶性蛋白的比例高達(dá)46.1%，非常適合作為遺傳轉(zhuǎn)化的載體，而且核基因組轉(zhuǎn)化有一些難以克服的缺陷，如核基因組基因數(shù)目和功能較葉綠體基因組復(fù)雜龐大得多，而且遺傳背景復(fù)雜，對(duì)于外源基因又難以控制等，另外，葉綠體作為半自主細(xì)胞器，具有一套自己的遺傳系統(tǒng)，可以防止基因污染、基因泄漏等問(wèn)題，因此，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化將成為繼核轉(zhuǎn)化之后的一項(xiàng)非常有效的遺傳轉(zhuǎn)化新技術(shù)。

致謝：該論文是第二屆全國(guó)草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文，并得到中國(guó)草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

[1] 邢少辰,CLARKE J L.葉綠體基因組研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008,35(1):21-28.

[2] Liu Z P,Chen Z Y,Pan J,Li X F,Su M,Wang L J,Li H J,Liu G S.Phylogenetic relationships in Leymus (Poaceae:Triticeae) revealed by the nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplasttrnL-Fsequences[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2008,46:278-289.

[3] 謝樹(shù)蓮,凌元潔.串珠藻目的現(xiàn)代地理分布和起源[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科版,2002,25(2):149-155.

[4] Correns C.The foundation of extranuclear inheritance:Plastid and mitochondrial genetics[J].Molecular Genetics and Genomics,2010,283(3):199-209.

[5] Ris H,Plaut W.Ultrastructure of DNA-containing areas in the chloroplast of Chlamydomonas[J].Biology of the Cell,1962,13:383-391 .

[6] 梁明山,陳斌,吳書惠.油菜葉綠體DNA的提取和純化[J].中國(guó)油料,1995,17(2):57-60.

[7] Maliga P.Toward plastid transformation in flowering plants[J].Tibtech,1993(11):101-107.

[8] Shinozaki K,Ohme M,Tanaka M,Wakasugi T,Hayashida N,Matsubayashi T,Zaita N,Chunwongse J,Obokata J,Yamaguchi S K,Ohto C,Torazawa K,Meng B Y,Sugita M,Deno H,Kamogashira T,Yamada K,Kusuda J,Takaiwa F,Kato A,Tohdoh N,Shimada H,Sugiura M.The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome its gene organization and expression[J].The EMBO Journal,1986,5(9):2043-2049.

[9] Ohyama K,Fukuzawa H,Kohchi T,Shirai H,Sano T,Sano S,Umesono K,Shiki Y,Takeuchi M,Chang Z,Aota S,Inokuchi H,Ozeki H.Chloroplast gene organization deduced from complete sequence of liverwortMarchantiapolymorphachloroplast DNA[J].Nature,1986,322:572-574.

[10] Jansen R K,Raubeson L A,Boore J L,Pamphilis C W,Chumley T W,Haberle R C,Wyman S K,Alverson A J,Peery R,Herman S J,Fourcade H M,Kuehl J V,McNeal J R,Leebens-Mack J,Cui L.Methods for obtaining and analyzing whole chloroplast genome sequences[J].Methods in Enzymology,2005,395:348-384.

[11] 張同武.植物細(xì)胞器基因組測(cè)序,組裝及比較基因組學(xué)研究[D].杭州:浙江大學(xué)博士論文,2012.

[12] Shahid Masood M,Nishikawa T,Fukuoka S,Njenga P K,Tsudzuki T,Kadowaki K.The complete nucleotide sequence of wild rice(Orizynivara) chloroplast genome:First genome wide comparative sequence analysis of wild and cultivated rice[J].Gene,2004,340(1):133-139.

[13] Tang J,Xia H,Cao M,Zhang X,Zeng W,Hu S,Tong W,Wang J,Wang J,Yu J,Yang H,Zhu L.A comparison of rice chloroplast genomes[J].Plant Physiology,2004,135(1):412-420.

[14] Hiratsuka J,Shimada H,Whittier R,Ishibashi T,Sakamoto M,Mori M,Kondo C,Honji Y,Sun C R,Meng B Y,Li Y Q,Kanno A,NishizawaY,Hirai A,Shinozaki K,Sugiura M.The complete sequence of the rice(Oryzasativa) chloroplast genome:Inter molecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals[J].Molecular and General Genetics,1989,217(2-3):185-194.

[15] 吉莉,謝樹(shù)蓮,馮佳.藻類植物葉綠體基因組研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2010,30(1):208-214.

[16] Kolondener R,Tewari K K.Inverted repeats in chloroplast DNA from high plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1979,76:41-45.

[17] Plamer J D.Isolation and structural analysis of chloroplast DNA[J].Methods and Enzymology,1986,118:167-186.

[19] Bookjans G,Stummann B M,Henningsen K W.Preparation of chloroplast DNA from pea plastids isolated in a medium of high ionic strength[J].Nalytical Biochemistry,1984,141(1):244-247.

[18] 胡華萃,王進(jìn),沈桂芳,唐愫.氯化銫密度梯度離心法純化葉綠體DNA[J].杭州大學(xué)學(xué)報(bào),1985,12(3):370-373.

[20] 趙衍,翁醒華.純化水稻葉綠體DNA的新方法[J].杭州大學(xué)學(xué)報(bào),1986,13(3):386-389.

[21] 龔小松,閻隆飛.高等植物葉綠體DNA提純方法的改進(jìn)[J].科學(xué)通報(bào),1991(6):467-469.

[22] Sanger F,Nicklen S,Coulson A R.DNA sequencing with chain terminating inhibitors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1977,74:5463-5467.

[23] Pyke K A. Plastid division and development[J].Plant Cell,1999,11(4):549-560.

[24] Cai Z,Guisinger M,Kim H G,Ruck E,Blazier J C,McMurty V,Kuehl J V,Boore J,Jansen R K.Extensive reorganization of the plastid genome ofTrifoliumsubterraneum(Fabaceae) is as sociated with numerous repeated sequences and novel DNA insertions[J].Journal of Molecular Evolution,2008,67(6):696-704.

[25] Jansen R K,Wojciechowski M F,Sanniyasi E,Lee S B,Daniell H.Complete plastid genome sequence of the chickpea (Cicerarietinum) and the phylogenetic distribution ofrps12 andclpPintron losses among legumes(Leguminosae)[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2008,48:1204-1217.

[26] Raghvendra A S.Photosynhesis:A comprehensive treatise[M].Cambridge:Cambridge University Press,1998:72-86.

[27] Cahoon A B,Sharpe R M,Mysayphonh C,Thompson E J,Ward A D,Lin A.The complete chloroplast genome of tall fescue (Loliumarundinaceum;Poaceae) and comparison of whole plastomes from the family Poaceae[J].American Journal of Botany,2010,97(1):49-58.

[28] Middleton C P,Senerchia N,Stein N,Akhunov E D,Keller B,Wicker T,Kilian B.Sequencing of chloroplast genomes from wheat,barley,rye and their relatives provides a detailed insight into the evolution of the triticeae tribe[J].PLoS ONE,2014,9(3):E85761.

[29] Diekmann K,Hodkinson T R,Fricke E,Barth S.An optimized chloroplast DNA extraction protocol for grasses (Poaceae) proves suitable for whole plastid genome sequencing and SNP detection[J].PLoS ONE,2008,3(7):E2813.

[30] Young H A,Lanzatella C L,Sarath G,Tobias C M.Chloroplast genome variation in upland and lowland switchgrass[J].PLoS ONE,2011,6(8):E23980.

[31] Bortiri E,Coleman-Derr D,Lazo G R,Anderson O D,Gu Y Q.The complete chloroplast genome sequence ofBrachypodiumdistachyon:Sequence comparison and phylogenetic analysis of eight grass plastomes[J].BMC Medical Reserarch Methodology,2008,1:61.

[32] Smith S A,Donoghuem J.Rates of molecular evolution are linked to life history in flowering plants[J].Science,2008,322:86-89.

[33] Katayama H,Ogihara Y.Structural alterations of the chloroplast genome found in grasses are not common in monocots[J].Current Genetics,1993,23(2):160-165.

[34] 唐萍,阮秋燕,彭程.禾本科植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)進(jìn)化研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(30):171-176.

[35] Doyle J J,Davis J I,Soreng R J,Garvin D,Anderson M J.Chloroplast DNA inversions and the origin of the grass family (Poaceae)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1992,89:7723-7726.

[36] Kato T,Kaneko T,Sato S,Nakamura Y,Tabata S.Complete structure of the chloroplast genome of a legume,Lotusjaponicus[J].Mutation Reserarch-DNA Repair,2000,7(6):323-330.

[37] Sveinsson S,Cronk Q.Evolutionary origin of highly repetitive plastid genomes within the clover genus(Trifolium)[J].BMC Evolutionary Biology,2014,14(1):228.

[38] Magee A M,Aspinall S,Rice D W,Cusack B P,Semon M,Perry A S,Stefanovic S,Milbourne D,Barth S,Palmer J D,Gray J C,Kavanagh T A,Wolfe K H.Localized hypermutation and associated gene losses in legume chloroplast genomes[J].Genome Reserach,2010,20(12):1700-1710.

[39] Martin G E,Rousseau-Gueutin M,Cordonnier S,Lima O,Michon-Coudouel S,Naquin D,de Carvalho J F,Ainouche M,Salmon A,Ainouche A.The first complete chloroplast genome of the Genistoid legumeLupinusluteus:Evidence for a novel major lineage-specific rearrangement and new insights regarding plastome evolution in the legume family[J].Phyton-Annales Rei Botanicae,2014,113(7):1197-1210.

[40] Millen R S,Olmstead R G,Adams K L,Palmer J D,Lao N T,Heggie L,Kavanagh T A,Hibberd J M,Gray J C,Morden C W,Calie P J,Jermiin L S,Wolfe K H.Many parallel losses of infA from chloroplast DNA during angiosperm evolution with multiple independent transfers to the nucleus[J].Plant Cell,2001,13(3):645-658.

[41] Palmer J D,Thompson W F.Rearrangements in the chloroplast genomes of mung bean and pea[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1981,78:5533-5537.

[42] Doyle J J,Doyle J L,Palmer J D.The distribution and phylogenetic significance of a 50 kb chloroplast DNA inversion in the flowering plant family Leguminosae[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,1996,5:429-438.

[43] Bruneau A,Doyle J J,Palmer J D.A chloroplast DNA inversion as a subtribal character in the Phaseoleae (Leguminosae)[J].Australian Systematic Botany,1990,15:378-386.

[44] Palmer J D,Osorio B,Thompson W F.Evolutionary significance of inversions in legume chloroplast DNAs[J].Current Genetics,1988,14(1):65-74.

[45] Liu Y,Huo N X,Dong L L,Wang Y,Zhang S X,Young H A,Feng X X,Gu Y Q.Complete chloroplast genome sequences of mongolia medicine artemisia frigida and phylogenetic relationships with other plants[J].PLoS ONE,2013,8(2):E57533.

[46] Dong W,Xu C,Cheng T,Lin K,Zhou S.Sequencing angiosperm plastid genomes made easy:A complete set of universal primers and a case study on the phylogeny of saxifragales[J].Genome Biology Evolution,2013,5(5):989-997.

[47] Lukas B,Novak J.The complete chloroplast genome ofOriganumvulgare(Lamiaceae)[J].Gene,2013,528(2):163-169.

[48] Jansen R K,Palmer J D.A chloroplast DNA inversion marks an ancient evolutionary split in the sunflower family(Asteraceae)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1987,84:5818-5822.

[49] Daniell H,Khan M S,Allison L.Milestones in chloroplast genetic engineering:An environmentally friendly era in biotechnology[J].Trends in Plant Science,2002,7:84-91.

[50] Grevich J J,Daniell H.Chloroplast genetic engineering:Recent advances and future perspectives[J].Critical Reviews in Plant Sciences,2005,24:83-107.

(責(zé)任編輯 王芳)

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Progress in chloroplast genome analysis of herbage

TAO Xiao-li, WANG Yan-rong, LIU Zhi-peng

(Key Laboratory of Grassland Farming Systems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Chloroplasts of plant is an important organelle of photosynthesis and energy conversion and it’s also an important carrier of female genetic information. Chloroplast genome information is valuable in revealing the evolution of species, hybrids, evolution, species identification and other aspects. With the rapid development of plant chloroplast genome research, researches in herbage chloroplast genome are also executed by leaps and bounds whereas some herbage have not been studied in-depth and only limited in the chloroplast genome sequences. As the importance of chloroplast genome research, the recent relevant information was collected and the latest research progress was summarized in this field from several aspects including isolation of chloroplast DNA, purification, sequencing to understand more about chloroplast DNA purification and the research of status, future trends and prospects of forage chloroplast genome.

herbage; chloroplast; genome; purification; sequencing

LIU Zhi-peng E-mail:lzp@lzu.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2015-0105

2015-02-14 接受日期：2015-04-21

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)——重要牧草、鄉(xiāng)土草抗逆優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的生物學(xué)基礎(chǔ)(2014CB138704)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目——紫花苜蓿種子發(fā)育分子機(jī)理的研究(31272492)

陶曉麗(1990-)，女，甘肅武威人，在讀碩士生，主要從事草坪生物學(xué)與生物技術(shù)研究。E-mail:taoxl14@lzu.edu.cn

劉志鵬(1979-)，男，陜西咸陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事草類作物分子育種研究。E-mail:lzp@lzu.edu.cn

S540.1;Q943.2

A

1001-0629(2015)06-0978-10

陶曉麗,王彥榮,劉志鵬.牧草葉綠體基因組研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(6):978-987.

TAO Xiao-li,WANG Yan-rong,LIU Zhi-peng.Progress in chloroplast genome analysis of herbage[J].Pratacultural Science,2015,32(6)：978-987.