春石斛品種Dendrobium Second Love‘Tokimeki’與金釵石斛多糖免疫活性的比較研究

王再花　李杰　章金輝　徐曄春　葉慶生

摘 要 為比較春石斛栽培品種Dendrobium Second Love‘Tokimeki與金釵石斛的粗多糖、精多糖（除蛋白多糖）和多糖水洗組分（過層析柱分離的水洗組分）的免疫活性差異，分別對(duì)昆明小鼠灌胃上述6種不同純度的多糖，觀察其對(duì)小鼠臟體指數(shù)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、抗體積數(shù)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分比與吞噬指數(shù)等免疫學(xué)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：2種石斛的免疫活性隨多糖純度的提高而增強(qiáng)，純度最高的多糖水洗組分免疫活性最強(qiáng)，且各指標(biāo)均顯著高于對(duì)照。D. Second Love ‘Tokimeki和金釵石斛同等純度的多糖在胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、小鼠耳腫脹率及小鼠抗體積數(shù)上均無顯著差異，而D. Second Love‘Tokimeki的3種不同純度多糖的吞噬指數(shù)均達(dá)到了與金釵石斛多糖水洗組分無顯著差異的水平。綜合來看，栽培品種D. Second Love‘Tokimeki的多糖免疫活性與金釵石斛多糖相近，具有良好的藥用開發(fā)價(jià)值。

關(guān)鍵詞 春石斛品種；Dendrobium Second Love‘Tokimeki；金釵石斛；多糖；免疫活性

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

春石斛為一類春天開花的石斛屬植物，在國際花卉市場(chǎng)和中國年宵花市場(chǎng)占有重要地位。金釵石斛（Dendrobium nobile）花色艷麗，花姿優(yōu)美，是觀賞價(jià)值極高的春石斛原生種[1]，同時(shí)也是中國名貴中藥材石斛的來源之一，為2010版《中國藥典》所收載[2]，其莖含有多糖、生物堿和多種小分子物質(zhì)[3-4]，而多糖作為其主要的有效成分，具有抗氧化[5]、免疫刺激活性[6]、抗腫瘤[7]和降低血糖[8]等藥理作用，因過度采挖其野生資源已逐漸稀少。春石斛栽培品種的原始雜交親本源于中國的金釵石斛等名貴藥用石斛[9]，前人研究結(jié)果也表明，多數(shù)栽培品種與金釵石斛的近緣關(guān)系較近[10]，目前人工選育的栽培品種已達(dá)上萬個(gè)，多以盆栽觀賞為目的進(jìn)行選育，而對(duì)于其藥用價(jià)值的研究利用甚少。筆者發(fā)現(xiàn)春石斛栽培品種的莖都不同程度的含有多糖[9]，并篩選出了高多糖含量品種Dendrobium Second Love ‘Tokimeki（23.7%）。本研究在此基礎(chǔ)上，以金釵石斛為對(duì)照，比較評(píng)估了不同純度的D. Second Love‘Tokimeki多糖和金釵石斛多糖在免疫器官指數(shù)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、巨噬細(xì)胞吞噬功能和抗體積數(shù)等免疫學(xué)指標(biāo)上的活性差異，旨在為從春石斛栽培品種中開發(fā)新的藥用石斛資源提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

春石斛Dendrobium Second Love‘Tokimeki為日本引進(jìn)栽培品種，金釵石斛（Dendrobium nobile）收集于云南，二者均栽培于溫室大棚內(nèi)。取成熟未開花石斛莖若干，切成小段，洗凈，105 ℃殺青15 min，60 ℃烘干至恒重，粉碎后過0.25 mm篩，置于干燥器中備用。試驗(yàn)小鼠為南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的昆明小鼠（20±2）g，雌雄各半。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取與純化 參照筆者前期報(bào)道的方法對(duì)石斛粉末進(jìn)行多糖提取和純化[11-12]，得到春石斛品種D. Second Love‘Tokimeki的粗多糖（DHCP）、精多糖（DHPP）、多糖水洗組分（DHPP-I）及金釵石斛的粗多糖（DNCP）、精多糖（DNPP）、多糖水洗組分（DNPP-I）。

1.2.2 分組與處理 昆明小鼠環(huán)境適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為7組，即3個(gè)D. Second Love‘Tokimeki多糖組（DHCP組、DHPP組和DHPP-I組）、3個(gè)金釵石斛多糖組（DNCP組、DNPP組和DNPP-I組）及對(duì)照組（CK），每組40只。各試驗(yàn)組按每20 g 0.4 mL每日1次灌胃對(duì)應(yīng)的多糖溶液（10 mg/mL），對(duì)照組則灌胃給予相同體積的蒸餾水。

1.2.3 免疫臟器重量的測(cè)定 每組各取昆明小鼠10只。參考張建峰等[13]的方法，連續(xù)灌胃15 d后，第16天處死小鼠，摘取脾臟和胸腺，計(jì)算臟體指數(shù)。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn) 每組各取昆明小鼠10只。連續(xù)灌胃10 d后，參考施子棣等[14]的方法，取雞血于有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝固定方向搖動(dòng)，脫去纖維，生理鹽水洗滌3次，每次2 000 r/min離心10 min，去除上清，用生理鹽水配成20%（V/V）的雞紅細(xì)胞懸液，每只小鼠腹腔注射該懸液1 mL，間隔30 min后，頸椎脫臼處死小鼠，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，于37 ℃溫箱孵育30 min。孵畢，置生理鹽水中漂洗，除去未貼片細(xì)胞，晾干，以1 ∶ 1丙酮甲醇溶液固定，4%（V/V） Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片計(jì)數(shù)100個(gè)，按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：

吞噬百分率=（吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)）×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

1.2.5 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng) 每組各取昆明小鼠10只。連續(xù)灌胃10 d后，參考張建峰等[13]的方法，先用硫化鋇在小鼠腹部皮膚約3 cm×3 cm范圍內(nèi)脫毛，然后用2，4-二硝基氟苯（DNFB）溶液50 μL均勻涂抹致敏。5 d后，用10 μL的DNFB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊，攻擊24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，分別稱重，以左、右耳片重量之差為腫脹度，按如下公式計(jì)算腫脹率：

腫脹率=[（試驗(yàn)組-對(duì)照組）/對(duì)照組]×100%

1.2.6 血清溶血素含量測(cè)定 每組各取昆明小鼠10只。連續(xù)灌胃10 d后，從綿羊頸靜脈取血，放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)固定方向搖動(dòng)，脫去纖維，用生理鹽水洗3次，每次于2 000 r/min，離心分離10 min，將積壓的綿羊血紅細(xì)胞用生理鹽水配成2%（V/V）的細(xì)胞懸液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行免疫。5 d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，靜置1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，于2 000 r/min離心分離10 min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋成2×、4×、8×和16×，并將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝試驗(yàn)板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5% （V/V）的綿羊血紅細(xì)胞懸液，充分混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度，參考江振友等[15]的方法計(jì)算抗體積數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)整理采用Excel 2010軟件，方差分析采用SAS 8.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛多糖對(duì)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

不同石斛多糖處理組對(duì)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響見表1。金釵石斛和春石斛品種D. Second Love ‘Tokimeki均隨著多糖純度的提高，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)逐漸變大，2種純度最高的多糖水洗組分（DNPP-I和DHPP-I）均顯著高于其他多糖處理和對(duì)照，D. Second Love‘Tokimeki精多糖（DHPP）的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)也顯著高于對(duì)照，而金釵石斛精多糖（DNPP）的胸腺指數(shù)與對(duì)照差異不顯著。金釵石斛和D. Second Love‘Tokimeki相同純度等級(jí)的多糖在胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)上差異不顯著，而2種石斛的粗多糖（DNCP和DHCP）的這2個(gè)指標(biāo)也與對(duì)照無顯著差異。

2.2 石斛多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響

由表2可看出，6種石斛多糖的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著高于對(duì)照，且多糖純度越高，效果越好。就吞噬百分率而言，品種D. Second Love ‘Tokimeki多糖DHPP-I效果最好，但與其精多糖DHPP和金釵石斛多糖DNPP-I差異不顯著，2種石斛的粗多糖DOCP和DWCP相對(duì)差些。就吞噬指數(shù)而言，品種D. Second Love‘Tokimeki的3種多糖效果均較好，三者間無顯著差異，且與金釵石斛多糖DNPP-I同樣差異不顯著，而多糖DNCP和DNPP則顯著低于D. Second Love‘Tokimeki的3種多糖。

2.3 石斛多糖對(duì)2，4-二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹率的影響

由圖1可知，隨著多糖純度的增加，小鼠耳腫脹率出現(xiàn)了不斷增加的趨勢(shì)，均顯著高于對(duì)照，品種D. Second Love‘Tokimeki和金釵石斛多糖的變化趨勢(shì)一致，且2種石斛同等純度的多糖間差異不顯著，以DHPP-I和DNPP-I的耳腫脹率最高，分別達(dá)47.2%和42.9%，二者顯著高于其他多糖處理和對(duì)照。

2.4 石斛多糖對(duì)小鼠抗體積數(shù)的影響

由圖2可看出，隨著石斛多糖純度的提高，抗體積數(shù)逐漸增大。品種D. Second Love‘Tokimeki多糖DHPP-I的抗體積數(shù)最高，金釵石斛多糖DNPP-I次之，二者間無顯著差異，但均顯著高于對(duì)照，而純度相對(duì)低些的粗多糖（DHCP與DNCP）和精多糖（DHPP與DNPP）則與對(duì)照差異不顯著。

3 討論

多糖化合物作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫作用。一般情況下，多糖通過影響巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成等，使得機(jī)體得到免疫力的增強(qiáng)，也可通過影響細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)成員之間的相互作用來調(diào)節(jié)免疫力[16-17]。石斛種類較多，前人曾從不同角度對(duì)鐵皮石斛[18-19]、金釵石斛[6]、霍山石斛[20]、流蘇石斛[21]和細(xì)莖石斛[22]等石斛的免疫活性進(jìn)行了初步研究，其中，宋美芳等[19]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖和齒瓣石斛多糖高劑量組均可明顯增加小鼠足趾腫脹度和脾臟指數(shù)，但各劑量組對(duì)小鼠胸腺指數(shù)無影響。金釵石斛方面，Luo等[6]發(fā)現(xiàn)金釵石斛水溶性多糖DNP4-2能顯著增強(qiáng)免疫指標(biāo)，促進(jìn)IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌， 降低血清中MDA的含量。Wang等[23]也發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖（DNP-3）能明顯增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞免疫活性。本研究則分析了3種不同純度的金釵石斛水溶性多糖對(duì)昆明小鼠免疫器官指數(shù)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、巨噬細(xì)胞吞噬功能和抗體積數(shù)等免疫學(xué)指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其純化的多糖水洗組分（DNPP-I）在上述指標(biāo)上都具有較好免疫活性，與前人在金釵石斛上的結(jié)果類似。

春石斛栽培品種的多糖生物活性還未被檢測(cè)和報(bào)道，與金釵石斛相比，栽培品種資源眾多，在栽培上有很強(qiáng)的生長與抗性優(yōu)勢(shì)，其多糖提取純化及藥理研究對(duì)新藥用石斛資源的開發(fā)具有重要意義。本研究選取了品種D. Second Love‘Tokimeki和金釵石斛比較，分別給昆明小鼠灌胃了2種石斛的粗多糖、精多糖和純化的多糖水洗組分，發(fā)現(xiàn)均隨著多糖純度的增加，其免疫活性越強(qiáng)，這與金釵石斛多糖、鐵皮石斛多糖和大苞鞘石斛多糖在抗氧化活性上的趨勢(shì)是一致的[11]。D. Second Love ‘Tokimeki和金釵石斛同等純度的多糖在胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、2，4-二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹率及小鼠抗體積數(shù)這些指標(biāo)上均無顯著差異，僅在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬百分率上存在顯著差異，即D. Second Love‘Tokimeki的3種不同純度多糖（DHCP，DHPP和DHPP-I）的吞噬指數(shù)均達(dá)到與金釵石斛多糖（DNPP-I）差異不顯著的水平，且均顯著高于金釵石斛多糖（DNPP與DNCP）和對(duì)照，而D. Second Love ‘Tokimeki多糖（DHPP）的吞噬百分率同樣顯著高于同等純度的金釵石斛多糖（DNPP），且與純度最高的DHPP-I和DNPP-I差異不顯著。可見，D. Second Love ‘Tokimeki多糖石斛對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的作用要略優(yōu)于金釵石斛。

綜上所述，春石斛栽培品種D. Second Love ‘Tokimeki多糖能顯著提高昆明小鼠的免疫器官指數(shù)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、巨噬細(xì)胞吞噬功能和抗體積數(shù)等免疫學(xué)指標(biāo)，整體上與金釵石斛多糖的免疫功能相當(dāng)，而在對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的作用要略優(yōu)于金釵石斛多糖，這為新的藥用石斛資源挖掘和石斛資源的創(chuàng)新利用提供了新的切入點(diǎn)，而該品種多糖是否具有其他藥理活性則有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 王 琳， 葉慶生， 劉 偉. 金釵石斛研究概況[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2004， 33（2）： 73-76.

[2] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典（第二部）[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 85-87.

[3] Xu J， Han Q B， Li S L， et al. Chemistry，bioactivity and quality control of Dendrobium， a commonly used tonic herb in traditional Chinese medicine[J]. Phytochem Rev， 2013， 12（2）：341-367.

[4] Ng T B， Liu J Y， Wong J H， et al. Review of research on Dendrobium， a prized folk medicine[J]. Appl Microbiol Biot，2012， 93（5）： 1 795-1 803.

[5] Luo A X， He X J， Zhou S D， et al. In vitro antioxidant activities of a water-soluble polysaccharide derived from Dendrobium nobile Lindl. Extracts[J]. Int J Biol Macromol，2009， 45（4）： 359-363.

[6] Luo A X， Fan Y J. Immune stimulating activity of water-soluble polysaccharide fractions from Dendrobium nobile Lindl[J]. Afr J Pharm Pharmaco， 2011， 5（5）： 625-631.

[7] Wang J H， Luo J P， Zha X Q， et al. Comparison of antitumor activities of different polysaccharide fractions from the stems of Dendrobium nobile Lindl[J]. Carbohyd Polym，2010， 79（1）： 114-118.

[8] 蔡 偉， 張宏桂， 劉朋朋，等. 金釵石斛水提物對(duì)鏈脲霉素高血糖小鼠的降血糖作用研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2013， 41（4）：15-17.

[9] 章金輝， 操君喜， 朱根發(fā)，等. 春石斛雜交種多糖及生物堿含量比較研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（4）： 727-731.

[10] Zhu G F， Li D M. Genetic relationships among native species and hybrid cultivars of Asian Dendrobium（Orchidaceae）using amplified fragment length polymorphism markers[J]. Hortscience， 2011， 46（1） ：192-196.

[11] 王再花， 章金輝， 李 杰， 等. 3種藥用石斛多糖的抗氧化活性比較研究[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015， 47（5）： 65-70.

[12] Sun Y D， Wang Z H， Ye Q S. Composition analysis and anti-proliferation activity of polysaccharides from Dendrobium chrysotoxum[J]， Int J Biol Macromol， 2013， 62（1）： 291-295.

[13] 張建峰， 昌友權(quán)， 陳 光，等. 紅曲多糖的免疫活性研究[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29（2）： 391-393.

[14] 施子棣， 何季芬， 張桂蘭，等. 金釵石解水煎液時(shí)小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能影響的實(shí)驗(yàn)觀察[J]. 河南中醫(yī)， 1989， 2（1）： 35-36.

[15] 江振友， 林 晨， 劉小澄，等. 靈芝多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 24（2）： 51-53.

[16] Ohri C M， Shikotra A， Green R H， et al. Tumour necrosis factor-alpha expression in tumour islets confers a survival advantage in non-small cell lung cancer[J]. BMC Cancer，2010， 323（10）： 1 186-1 192.

[17] Bermudez L E， Stevens P， Kolonoski P， et al. Treatment of experimental disseminated Mycobacterium avium complex infection in mice with recombinant IL-2 and tumor necrosis factor[J]. J Immunol， 1989， 143（9）： 2 996-3 000.

[18] Xia L J， Liu X F， Guo H Y， et al. Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale（Tiepishihu）in vitro[J]. J Funct Foods， 2012， 4（1）： 294-301.

[19] 宋美芳， 李 光， 陳 曦，等. 兩種石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2013， 48（6）： 428-431.

[20] Zha X Q， Zhao H W， Bansal V， et al. Immunoregulatory activities of Dendrobium huoshanense polysaccharides in mouse intestine， spleen and liver[J]. Int J Biol Macromol， 2014， 64（2）： 377-382.

[21] 張 展. 流蘇石斛多糖分離純化、結(jié)構(gòu)分析及免疫活性研究[D]. 合肥： 合肥工業(yè)大學(xué)， 2013.

[22] 陳璋輝， 陳云龍， 吳 濤， 等. 細(xì)莖石斛多糖DMP4a-1的結(jié)構(gòu)特性及免疫活性研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2005， 40（23）： 1 781-1 783.

[23] Wang J H， Luo J P， Yang X F， et al. Structural analysis of a rhamnoarabinogalactan from the stems of Dendrobium nobile Lindl.[J]. Food Chem， 2010， 122（3）： 572-576.