刺激隱核蟲感染誘導(dǎo)斜帶石斑魚MHCIα和β2m基因的表達(dá)譜分析

徐冬冬 徐舜 吳鳳依 羅曉春

摘要：【目的】檢驗石斑魚（Epinephelus coioides）MHC I α和β2m基因是否參與誘導(dǎo)抗寄生蟲免疫應(yīng)答，為揭示魚類免疫系統(tǒng)啟動抗刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答分子機制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳詫崟r熒光定量PCR對刺激隱核蟲感染斜帶石斑魚前后MHC I α和β2m基因在感染局部位點和免疫器官中的表達(dá)變化進行檢測。【結(jié)果】MHC I α和β2m基因在健康斜帶石斑魚的組織中均呈組成性表達(dá)，且以在外周血、腮、頭腎和脾臟中的表達(dá)量較高。經(jīng)刺激隱核蟲感染后，MHC I α和β2m基因在斜帶石斑魚皮膚中的表達(dá)明顯上調(diào)，均在感染后第5 d達(dá)峰值，其中MHC I α基因的最大表達(dá)量為2.6倍、β2m基因的最大表達(dá)量為6.1倍；在腮中二者呈波動性變化，而在頭腎中以顯著下調(diào)為主。在脾臟中，MHC I α基因在刺激隱核蟲感染后第5 d顯著上調(diào)表達(dá)，為對照組的2.0倍，至感染后第7 d其表達(dá)水平略微下調(diào)，為對照組的1.5倍；β2m基因表達(dá)于感染后12 h即升高至對照組的4.0倍，此后呈下調(diào)表達(dá)趨勢，至感染后第5 d其表達(dá)水平再次上調(diào)為對照組的3.4倍?！窘Y(jié)論】在刺激隱核蟲感染過程中，斜帶石斑魚MHC I α和β2m基因的相對表達(dá)量在皮膚、鰓、頭腎和脾臟中均發(fā)生了明顯變化，即魚類MHC I類分子可能參與了機體的細(xì)胞免疫，在抗寄生蟲感染的特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 石斑魚；刺激隱核蟲；MHC I α基因；β2m基因；表達(dá)譜分析

中圖分類號： S965.334 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2145-06

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to verify whether MHC I α and β2m genes in Epinephelus coioides were invovled in the induction of anti-parasite immune response and lay a foundation to reveal molecular mechanism of cellular imune response started of infected fish by Cryptocaryon irritans. 【Method】Real-time quantitative PCR was applied to investigate expression levels of MHC I α and β2m genes before and after E. coioides infected by C. irritans in local infection sites and immune organs. 【Result】MHC I α and β2m genes were both constitutively expressed in healthy tissues of E. coioides， with higher expressions in peripheral blood， gill， spleen and head kidney. After infected by C. irritans， significant up-regulations of MHC I α and β2m genes were detected in skin and reached the peak on day 5 post infection. The maximum expression of MHC I α gene was 2.6 times and β2m gene 6.1 times. They were both fluctuated in gill and their significant declines were observed in head kidney at most time points. In spleen， the expression of MHC I α gene was up-regulated on day 5 significantly after infected by C. irritans， which was as 2 times as that in CK； and slightly declined on day 7， which was as 1.5 times as that in CK. In terms of β2m gene， the expression was un-regulated after 12 hours of infection and as high as 4.0 times of that in CK； later the expression was down-regulated until day 5， when the expression was up-regulated again to 3.4 times of that in CK. 【Conclusion】During C. irritans infection process， the relative expressions of MHC I α and β2m genes in E. coioides are both found to be significantly regulated in skin， gill， spleen and head kidney. These results indicate that fish MHC I molecule may be involved in cellular immune and play an important role in activation of specific cellular immune response to parasites.

Key words： Epinephelus coioides； Cryptocaryon irritans； MHC I α gene； β2m gene； expression pattern analysis

0 引言

【研究意義】斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）俗稱青斑、老虎斑，隸屬于鮨科（Serranidae）石斑魚屬（Epinephelus），是我國南方地區(qū)養(yǎng)殖的重要名貴海水魚類，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化等，其寄生蟲病害暴發(fā)日趨頻繁。刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）是感染我國華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類最嚴(yán)重的一種寄生蟲，主要感染海水硬骨魚類，引發(fā)致死性、暴發(fā)性傳染?。╕ambot et al.，2003），對廣東、廣西、福建等地的海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。在魚類抗寄生蟲感染過程中除了抗體應(yīng)答外，特異性細(xì)胞免疫可能也發(fā)揮了重要作用。特異性細(xì)胞免疫最初始的啟動需要MHC I對抗原的遞呈，進而激活CD8+ T淋巴細(xì)胞，因此在建立的石斑魚—刺激隱核蟲感染模型基礎(chǔ)上，研究MHC類分子兩個亞基MHC I α和β2m的功能及表達(dá)調(diào)控規(guī)律，對揭示石斑魚細(xì)胞免疫抗寄生蟲感染的機制及研發(fā)其基因工程疫苗具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】MHC最初在小鼠腫瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)中被發(fā)現(xiàn)，隨后研究證實該基因普遍存在于各種脊椎動物中（Kaufman et al.，1985；Bensaid et al.，1991；馬曉茜等，2011）。MHC I類分子是由一條α鏈和一條β鏈通過非共價鍵結(jié)合形成的異源二聚體（耿昕穎等，2015）。α鏈又稱重鏈，是MHC I α基因編碼的跨膜糖蛋白；β鏈又稱輕鏈，是β微球蛋白（β2-microglobulin，β2m）基因編碼的多肽。與哺乳動物MHC I類分子結(jié)構(gòu)相比，魚類MHC I類分子具有較相似的結(jié)構(gòu)。魚類MHC I類分子主要負(fù)責(zé)內(nèi)源性抗原肽的加工與遞呈，其重鏈多肽結(jié)合區(qū)通常先結(jié)合多個氨基酸的抗原肽，折疊形成特定空間構(gòu)型，隨后再與β2m結(jié)合，共同組成穩(wěn)定的抗原多肽-MHCI類分子復(fù)合體，最后遞呈給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，觸發(fā)免疫反應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞。MHC基因作為魚類的主要免疫基因，在免疫應(yīng)答調(diào)控、抗原加工遞呈等過程中發(fā)揮重要作用，常用來揭示魚類抗病性的免疫基礎(chǔ)（Grimholt et al.，2003；董忠典等，2011）。魚類MHC基因最早在鯉魚中被發(fā)現(xiàn)（Hashimoto et al.，1990），發(fā)展至今已對多種魚類的MHC I類基因進行了相關(guān)研究，包括牙鲆（Srisapoome et al.，2004）、青石斑魚（王海燕等，2008）、草魚（楊玲等，2013）、黑鱸（Pinto et al.，2013）和團頭魴（Luo et al.，2014）等。此外，從斑馬魚（Ono et al.，1993）、鮸魚（Xu et al.，2011）、紅笛鯛（張新中等，2012）、赤點石斑魚（沈銘輝等，2013）等魚類中克隆獲得MHC I α基因，從草魚（Hao et al.，2006）、鰣魚（Christie et al.，2007）、大黃魚（Yu et al.，2009）等魚類中克隆獲得β2m基因。在魚類MHC基因表達(dá)調(diào)控方面，Xu等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在鰻弧菌感染過程中鮸魚MHC I α基因在脾臟和頭腎中的表達(dá)呈先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢；Luo等（2014）用嗜水氣單胞菌感染團頭魴，發(fā)現(xiàn)感染72 h后MHC I類基因呈顯著上調(diào)表達(dá)；Sever等（2014）以病毒性出血性敗血癥病毒感染虹鱒，發(fā)現(xiàn)病毒感染14 d后MHC I α和β2m基因的表達(dá)均呈上調(diào)趨勢?！颈狙芯壳腥朦c】斜帶石斑魚是我國南方地區(qū)重要的名貴海水魚類（Luo et al.，2007），近年來有關(guān)其免疫系統(tǒng)的相關(guān)基因已有研究報道（Dan et al.，2013；Wei et al.，2014），但尚無針對刺激隱核蟲感染前后MHC I α和β2m基因表達(dá)模式的詳細(xì)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過檢測魚類MHC I α和β2m基因在石斑魚感染后局部位點和免疫器官中的表達(dá)情況，檢驗其是否參與誘導(dǎo)抗寄生蟲免疫應(yīng)答，以期為揭示魚類免疫系統(tǒng)啟動抗刺激隱核蟲感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答分子機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試斜帶石斑魚由廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心提供，平均體重12.3±3.3 g，整個生長過程無刺激隱核蟲感染記錄。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher公司；DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠購自BIOWEST公司；DNA Purification Kit Ver.2.0購自TaKaRa公司；氯仿、異丙醇及無水乙醇購自北京普博欣生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1. 2 組織樣品采集

參照李言偉（2012）的方法，采集健康斜帶石斑魚皮膚、鰓、頭腎、脾臟、外周血、腦、肌肉、胸腺、中腸、體腎、胃、肝臟和心臟等13個組織樣品；刺激隱核蟲感染后，分別于0、6、12 h和1、2、3、5、7 d采集皮膚、鰓、頭腎和脾臟等4個組織樣品。組織采集完成后，迅速液氮凍存，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 RNA提取及cDNA合成

參照李言偉（2012）的方法，采用Trizol法提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 引物設(shè)計

應(yīng)用BLAST程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行目標(biāo)基因的同源性搜索和比對，發(fā)現(xiàn)MHC I α重鏈（2618 bp）和β2m的EST序列（2830 bp）與其他魚類的對應(yīng)基因均具有較高同源性，以O(shè)RF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進行開放閱讀框分析，然后采用Beacon Designer v7.21針對實時熒光定量PCR的引物設(shè)計要求，在目的基因的保守區(qū)設(shè)計特異性引物（表1）。以β-actin基因為內(nèi)參基因。

1. 5 實時熒光定量PCR

將所有取樣組織的cDNA樣品濃度調(diào)節(jié)一致，以β-actin基因為內(nèi)參基因，在羅氏LightCycler 480儀器上進行實時熒光定量PCR擴增，擴增體系10.0 μL，每組3個平行。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系配套使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒，按說明進行加樣（李言偉，2012）。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集一次熒光，進行熒光信號檢測。實時熒光定量PCR結(jié)束后導(dǎo)出Ct值，處理與分析定量數(shù)據(jù)。

1. 6 統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR擴增結(jié)果采用2-ΔΔCt進行換算處理，以SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。用Duncans進行不同時間點感染組與正常對照組間的顯著性分析，并利用Origin 8.0制圖，了解目的基因在13個正常組織的分布及感染后基因表達(dá)變化情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

斜帶石斑魚總RNA的電泳結(jié)果顯示，共獲得3條RNA特征性條帶（28S、18S和5S），其中以28S和18S條帶較清晰，且28S和18S的亮度比約2∶1，表明提取的RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗。

2. 2 cDNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

以反轉(zhuǎn)錄獲得的斜帶石斑魚cDNA為模板，對β-actin基因進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得條帶清晰、單一的特異性目的條帶，說明cDNA質(zhì)量完好，可用于實時熒光定量PCR擴增。

2. 3 健康斜帶石斑魚MHC I α和β2m基因的組織分布情況

如圖3所示，在正常生理狀態(tài)下，MHC I α基因在斜帶石斑魚的多個組織均有表達(dá)，包括皮膚、腮、頭腎、脾臟、體腎、外周血、胸腺、肝臟、腦、中腸、胃、心臟和肌肉。MHC I α基因在斜帶石斑魚的13個組織中呈組成性表達(dá)，其中表達(dá)量最低的組織是胃和腦。MHC I α基因在斜帶石斑魚外周血中表達(dá)量最高，其次是腮、頭腎和脾臟；在心臟、中腸、胸腺和肝臟中的表達(dá)水平略高于肌肉、皮膚和體腎。

實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在所有組織中均能檢測到β2m基因，即在斜帶石斑魚中廣泛表達(dá)。β2m基因在斜帶石斑魚的13個組織中仍以在外周血中的表達(dá)水平最高，其次是皮膚和腮；在體腎、肝臟和中腸中的表達(dá)水平相對較低，但以在胃中的表達(dá)水平最低。

2. 4 刺激隱核蟲感染后斜帶石斑魚MHC I α和β2m基因的表達(dá)變化

采用實時熒光定量PCR檢測抗原遞呈MHC I通路MHC I α和β2m基因在皮膚、腮、頭腎和脾臟4個組織中的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，經(jīng)刺激隱核蟲感染后，MHC I α和β2m基因在斜帶石斑魚皮膚中的表達(dá)量均在感染后第5 d達(dá)峰值，其中MHC I α基因的最大表達(dá)量為2.6倍、β2m基因的最大表達(dá)量為6.1倍。

在斜帶石斑魚皮膚組織中，MHC I α基因在所有感染時間點均呈上調(diào)表達(dá)；在腮中的表達(dá)水平呈波動性變化；而在頭腎中整體上呈下調(diào)趨勢；在脾臟中，MHC I α基因在刺激隱核蟲感染后3 d內(nèi)仍維持在較低水平，感染組與對照組間無明顯差異，但在感染后第5 d，MHC I α基因表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05，下同），為對照組的2.0倍，至感染后第7 d其表達(dá)水平略微下調(diào)，為對照組的1.5倍（圖4）。

經(jīng)刺激隱核蟲感染后，β2m基因在石斑魚皮膚和脾臟中呈時間相關(guān)性表達(dá)。尤其在皮膚中，β2m基因在所有感染時間點均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，且在感染后第5 d達(dá)最高值（6.1倍）；β2m基因在腮和頭腎中主要以下調(diào)表達(dá)為主；在脾臟中，β2m基因表達(dá)于感染后12 h即升高至對照組的4.0倍，此后β2m基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢，至感染后第5 d其表達(dá)水平再次上調(diào)為對照組的3.4倍，但至感染后第7 d又出現(xiàn)明顯下調(diào)，其表達(dá)量降至最小值（圖5）。

3 討論

本研究通過實時熒光定量PCR檢測MHC I α和β2m基因在斜帶石斑魚13個免疫和非免疫相關(guān)組織中的表達(dá)分布情況，結(jié)果顯示，MHC I α和β2m基因在脾臟、頭腎、鰓和外周血均具有較高的表達(dá)水平，但在肝臟和肌肉中的表達(dá)水平相對較低。Hansen等（1996）以RNA印跡法克隆虹鱒MHC I類基因的結(jié)果顯示，表達(dá)水平較高的組織有心臟、腸、體腎、胸腺、脾臟和頭腎，而在肌肉、腦和肝臟中表達(dá)量較低。Shum等（1996）、Yu等（2009）也先后在虹鱒和大黃魚中發(fā)現(xiàn)β2m基因在其肌肉及腦組織中的表達(dá)量均較低。沈銘輝等（2013）研究證實，赤點石斑魚MHC I α基因在各組織中的表達(dá)量以肝臟、腸、胸腺及頭腎較高，表達(dá)量最低的組織是肌肉、血液和胃。Luo等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，團頭魴MHC I類基因在10個組織中廣泛分布，尤以在腎臟、腸、腮和脾臟等免疫相關(guān)組織中的表達(dá)量較高。可見，魚類MHC I類基因的表達(dá)規(guī)律具有組織特異性。

刺激隱核蟲是一種胞外寄生性纖毛蟲，感染海水硬骨魚后主要寄生在皮膚和鰓，嚴(yán)重時甚至感染眼球，肉眼可觀察到感染組織上附著有大量鹽粒狀小白點，故又稱海水白點?。╕ambot et al.，2003）。刺激隱核蟲宿主范圍較廣，幾乎可感染所有海水硬骨魚類。Wang等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，刺激隱核蟲能不同程度地感染廣東地區(qū)包括籃子魚在內(nèi)的8種經(jīng)濟魚類。本研究以實時熒光定量PCR檢測刺激隱核蟲感染后斜帶石斑魚MHC I α和β2m基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，經(jīng)刺激隱核蟲感染后斜帶石斑魚皮膚、頭腎、脾臟和腮中的MHC I α和β2m基因表達(dá)水平均發(fā)生變化。MHC I α和β2m基因在斜帶石斑魚皮膚的表達(dá)量均在感染后第5 d達(dá)峰值，其中MHC I α基因的最大表達(dá)量為2.6倍、β2m基因的最大表達(dá)量為6.1倍。MHC I α和β2m基因在皮膚組織中呈明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢，預(yù)示著皮膚或許是刺激隱核蟲感染后抗原遞呈的主要位點。MHC Iα和β2m基因在斜帶石斑魚腮中均呈波動性變化，而在頭腎中以顯著下調(diào)為主。β2m基因在脾臟的表達(dá)水平于刺激隱核蟲感染后12 h達(dá)峰值（4.0倍），至刺激隱核蟲感染后第5 d，其表達(dá)量出現(xiàn)第二個峰值（3.4倍）。MHC I類兩個亞基基因（MHC I α和β2m）在脾臟和頭腎兩個系統(tǒng)免疫器官中表達(dá)量發(fā)生明顯變化，說明MHC I類分子在抗寄生蟲感染過程中可能參與了機體的系統(tǒng)免疫應(yīng)答。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以氫化可的松處理刺激隱核蟲免疫的石斑魚雖然抗體效價與未處理組的差異不顯著，但對宿主保護率明顯降低，說明在抗寄生蟲感染過程中，除特異性抗體發(fā)揮作用外，細(xì)胞免疫也發(fā)揮了重要作用（柏建山，2007）。Jose Priya等（2012）在刺激隱核蟲感染石斑魚的過程中觀察到感染位點有白細(xì)胞浸潤，刺激隱核蟲滋養(yǎng)體上CD8+ T細(xì)胞的附著也揭示抗寄生蟲感染過程存在細(xì)胞免疫作用。刺激隱核蟲為胞外寄生蟲，主要感染魚類的皮膚和鰓，嚴(yán)重時可感染眼球。但本研究結(jié)果表明，在刺激隱核蟲感染過程中，除了在斜帶石斑魚局部感染位點的皮膚和鰓外，在其脾臟、頭腎等系統(tǒng)免疫組織中MHC I α和β2m基因的表達(dá)譜均發(fā)生了明顯變化，可能是在刺激隱核蟲感染斜帶石斑魚的過程中出現(xiàn)了類似的交叉遞呈現(xiàn)象，通過MHC I類分子對抗原的遞呈激活CD8+ T淋巴細(xì)胞，啟動特異性細(xì)胞免疫在抗寄生蟲感染過程中的積極作用。交叉遞呈是指經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞吞噬捕獲的外源性抗原經(jīng)加工和遞呈傳遞到MHC I分子的過程。自Bevan（2010）發(fā)現(xiàn)CD8+ T細(xì)胞交叉遞呈現(xiàn)象以來，引發(fā)了人們對MHC I類分子通常專一性遞呈內(nèi)源性抗原這一觀點的重新思考，但刺激隱核蟲感染后石斑魚的MHC I類分子細(xì)胞免疫應(yīng)答機制仍有待進一步探究證實。

4 結(jié)論

在刺激隱核蟲感染過程中，斜帶石斑魚MHC I α和β2m基因的相對表達(dá)量在皮膚、鰓、頭腎和脾臟中均發(fā)生了明顯變化，即魚類MHC I類分子可能參與了機體的細(xì)胞免疫，在抗寄生蟲感染的特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)：

柏建山. 2007. 刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）誘導(dǎo)的石斑魚免疫反應(yīng)特征及其阻動抗原基因的克隆與分析[D]. 廣州：中山大學(xué).

Bai J S. 2007. The characters of grouper immune response elicited by Cryptocaryon irritans and cloning and analysis of its immobilization antigen gene[D]. Guangzhou：Sun Yat-sen University.

董忠典，周芬娜，王慧. 2011. MHC基因的遺傳變異及其與魚類抗病性研究進展[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，32（2）：6-10.

Dong Z D，Zhou F N，Wang H. 2011. Research advances of MHC genetic variation and disease resistance of fish[J]. Jo-

urnal of Hydroecology，32（2）：6-10.

耿昕穎，王家禎，王巍，單曉楓，馬紅霞，高云航. 2015. 魚類MHC及其基因的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，54（25）：126-128.

Geng X Y，Wang J Z，Wang W，Shan X F，Ma H X，Gao Y H. 2015. The research progress of major histocompatibility complex（MHC） and relevant gene in fish[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，54（25）：126-128.

李言偉. 2012. 石斑魚TLRs功能及刺激隱核蟲感染后免疫相關(guān)基因表達(dá)分析[D]. 廣州：中山大學(xué).

Li Y W. 2012. Research on TLRs and immune-related genes expression profile of grouper infected with Cryptocaryon irritans[D]. Guangzhou：Sun Yat-sen University.

馬曉茜，劉至治，李思發(fā)，唐文喬，楊金權(quán). 2011. 團頭魴主要組織相容性復(fù)合體Ι類基全長cDNA的克隆及組織表達(dá)分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，20（1）：34-43.

Ma X Q，Liu Z Z，Li S F，Tang W Q，Yang J Q. 2011. Full length cDNA cloning and tissue expression of major histocompatibility complex（MHC） class Ⅰ from blunt snout bream （Megalobrama amblycephala）[J]. Journal of Shanghai Ocean University，20（1）：34-43.

沈銘輝，鄭樂云，杜佳瑩，王軍. 2013. 赤點石斑魚MHC IA基因的克隆與表達(dá)多態(tài)性分析[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），52（1）：103-108.

Shen M H，Zheng L Y，Du J Y，Wang J. 2013. Cloning and polymorphisms analysis of MHC class IA gene form Epinephelus akaara[J]. Journal of Xiamen University（Natural Science），52（1）：103-108.

王海燕，劉勇，張甲，張冰. 2008. 青石斑魚MHC classI基因的克隆與分析[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，18（11）：14-20.

Wang H Y，Liu Y，Zhang J，Zhang B. 2008. Cloning and sequence analysis of the major histocompatibility class I gene in the teleost garrupa（Epinephelus awaara）[J]. Chinese Journal of Comparative Medicine，18（11）：14-20.

楊玲，孟慶磊，張龍崗，張志山. 2013. 草魚MHC class I基因多態(tài)性及其與魚體抗柱形病能力關(guān)系分析[J]. 長江大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），10（17）：42-47.

Yang L，Meng Q L，Zhang L G，Zhang Z S. 2013. Polymorphism of major histocompatibility complex class I allele and its association with resistance/susceptibility to Flavobacterium cloumnare in Ctenopharynodon idellus[J]. Journal of Yangtze University （Natural Science Edition），10（17）：42-47.

張新中，魯義善，吳灶和，簡紀(jì)常. 2012. 紅笛鯛主要組織相容性復(fù)合物Ια抗原基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，36（10）：1482-1492.

Zhang X Z，Lu Y S，Wu Z H，Jian J C. 2012. Cloning and expression analysis of histocompatibility complex I α antigen （MHC I α） form humphead snapper Lutjanus sanguineus[J]. Journal of Fisheries of China，36（10）：1482-1492.

Bensaid A，Kaushal A，Baldwin C L，Clevers H，Young J R，Kemp S J，MacHugh N D，Toye P G，Teale A J. 1991. Identification of expressed bovine class I MHC genes at two loci and demonstration of physical linkage[J]. Immunogenetics，33（4）：247-254.

Bevan M J. 2010. Cross-priming for a secondary cytotoxic response to minor H antigens with H-2 congenic cells which do not cross-react in the cytotoxic assay[J]. The Journal of Experimental Medicine，185（3）：1283-1288.

Christie D，Wei G，F(xiàn)ujiki K，Dixon B. 2007. Cloning and cha-

racterization of a cDNA encoding walleye（Sander vitreum） beta-2 microglobulin[J]. Fish & Shellfish Immunology，22（6）：727-733.

Dan X M，Zhang T W，Li Y W，Li A X. 2013. Immune responses and immune-related gene expression profile in orange-spotted grouper after immunization with Cryptocaryon irritans vaccine[J]. Fish & Shellfish Immunology，34（3）：885-891.

Grimholt U，Larsen S，Nordmo R，Midtlyng P，Kjoeglum S，Storset A，Saeb S，Stet R J. 2003. MHC polymorphism and disease resistance in Atlantic salmon（Salmo salar）； facing pathogens with single expressed major histocompatibility class I and class II loci[J]. Immunogenetics，55（4）：210-219.

Hansen J D，Strassburger P，Du Pasquier L. 1996. Conservation of an alpha 2 domain within the teleostean world，MHC class I from the rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J]. Developmental & Comparative Immunology，20（6）：417-425.

Hao H F，Yang T Y，Yan R Q，Gao F S，Xia C. 2006. cDNA cloning and genomic structure of grass carp （Ctenophayngodon idellus） beta2-microglobulin gene[J]. Fish & Shellfish Immunology，20（1）：118-123.

Hashimoto K，Nakanishi T，Kurosawa Y. 1990. Isolation of carp genes encoding major histocompatibility complex antigens[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，87（17）：6863-6867.

Kaufman J F，F(xiàn)lajnik M F，Du Pasquier L，Riegert P. 1985. Xenopus MHC class II molecules. I. Identification and structural characterization[J]. Journal of Immunology，134（5）：3248-3257.

Luo W，Zhang J，Wen J F，Liu H，Wang W M，Gao Z X. 2014. Molecular cloning and expression analysis of major histocompatibility complex class I， IIA and IIB genes of blunt snout bream（Megalobrama amblycephala）[J]. Developmental and Comparative Immunology，42（2）：169-173.

Luo X C，Xie M Q，Zhu X Q，Li A X. 2007. Protective immunity in grouper （Epinephelus coioides） following exposure to or injection with Cryptocaryon irritans[J]. Fish & Shellfish Immunology，22（4）：427-432.

Ono H，F(xiàn)igueroa F，OHUigin C，Klein J. 1993. Cloning of the beta 2-microglobulin gene in the zebrafish[J]. Immunogenetics，38（1）：1-10.

Pinto R D，Randelli E，Buonocore F，Pereira P J，dos Santos N M. 2013. Molecular cloning and characterization of sea bass （Dicentrarchus labrax， L.） MHC class I heavy chain and beta 2-microglobulin[J]. Developmental and Comparative Immunology，39（3）：234-254.

Jose Priya T A，Lin Y H，Wang Y C，Yang C S，Chang P S，Song Y L. 2012. Codon changed immobilization antigen（iAg），a potent DNA vaccine in fish against Cryptocaryon irritans infection[J]. Vaccine，30（5）：893-903.

Sever L，Vo N T K，Lumsden J，Bols N C，Dixon B. 2014. Induction of rainbow trout MH class I and accessory proteins by viral haemorrhagic septicaemia virus[J]. Molecular Immuno-

logy，59（2）：154-162.

Shum B P，Azumi K，Zhang S，Kehrer S R，Raison R L，Detrich H W，Parham P. 1996. Unexpected beta2-microglobulin sequence diversity in individual rainbow trout[J]. Procee-

dings of the National Academy of Sciences of the United States of America，93（7）：2779-2784.

Srisapoome P，Ohira T，Hirono I，Aoki T. 2004. Cloning，characterization and expression of cDNA containing major histocompatibility complex class I， II ± and II 2 genes of Japanese flounder Paralichthys olivaceus[J]. Fisheries Science，70（2）：264-276.

Wang F H，Xie M Q，Li A X. 2010. A novel protein isolated from the serum of rabbitfish（Siganus oramin） is lethal to Cryptocaryon irritans[J]. Fish & Shellfish Immunology，29（1）：32-41.

Wei S N，Huang Y H，Huang X H，Cai J，Yan Y，Guo C Y，Qin Q W. 2014. Characterization of cathepsin B gene from orange-spotted grouper，Epinephelus coioides involved in SGIV infection[J]. Fish & Shellfish Immunology，36（1）：194-205.

Xu T J，Sun Y N，Cheng Y Z，Shi G，Wang R X. 2011. Genomic sequences comparison and differential expression of miiuy croaker MHC class I gene， after infection by Vibrio anguillarum[J]. Developmental and Comparative Immunology，35（4）：483-489.

Yambot A V，Song Y L，Sung H H. 2003. Characterization of Cryptocaryon irritans， a parasite isolated from marine fishes in Taiwan[J]. Diseases of Aquatic Organisms，54（2）：147-156.

Yu S H，Chen X H，Ao J Q. 2009. Molecular characterization and expression analysis of beta2-microglobulin in large yellow croaker Pseudosciaena crocea[J]. Molecular Biology Reports，36（7）：1715-1723.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）