微小RNA—22在食管癌中的表達及臨床意義

胡立華　陳鵬　常英娟

[摘要] 目的 探討微小RNA-22（miRNA-22）在食管癌組織中的表達及與食管癌臨床病理特征間的關(guān)系。 方法 采用實時定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法檢測48例食管癌及癌旁組織中miRNA-22的表達水平，分析miRNA-22表達水平與食管癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。 結(jié)果 食管癌組織中miRNA-22相對表達量明顯低于相應(yīng)正常癌旁組織（3.51±1.05 vs 11.23±2.95），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miRNA-22低表達與腫瘤TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而與性別、年齡、分化程度無明顯相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論 miRNA-22在食管癌組織中的表達下調(diào)與食管癌的臨床病理特征密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 微小核糖核酸；食管癌；微小核糖核酸-22；實時定量PCR

[中圖分類號] R735.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）16-0021-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues and the relationship with the clinical pathologic features. Methods Real-time PCR was used to detect the miRNA-22 expressions among 48 cases of esophageal cancer tissues and matched adjacent tissues.The expression of miRNA-22 and clinic pathological features were analyzed. Results The esophageal cancer tissues showed aberrant down regulation of miRNA-22 compared with the adjacent non-tumor tissues（3.51±1.05 vs 11.23±2.95， P<0.05）.Lower miRNA-22 level was strongly associated with TNM stage and lymph node metastasis（P<0.05）. The correlation statistical analysis result indicated that there was no significant difference in sex， age and differentiation grade（P>0.05）. Conclusion The lower expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues is associated with clinic pathological features.

[Key words] MicroRNA； Esophageal cancer； MicroRNA-22； Real-time PCR

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于早期缺乏特異性癥狀，臨床確診的食管癌病例多為中、晚期患者，其5年生存率僅為10%左右。因而探索敏感、特異的腫瘤標記物，早期診斷，對降低食管癌的死亡率尤為重要。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）表達失調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤標記物用以腫瘤的診斷及治療。本研究通過檢測miRNA-22在食管癌及癌旁組織中的表達，旨在探討其與食管癌臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年1～12月黑龍江省醫(yī)院及黑龍江省腫瘤醫(yī)院外科手術(shù)切除的食管癌及癌旁正常組織標本48例，液氮凍存30 min，-80℃保存，所有樣品均經(jīng)病理診斷證實，術(shù)前均未接受放、化療。其中男34例，女14例，年齡41～88歲。癌癥分期按國家癌癥聯(lián)盟（UICC）第7版指南標準劃分，其中Ⅱ期15例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例，分化程度：中分化33例，低分化15例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。

1.2 總RNA提取

將食管癌及癌旁正常組織研碎，利用Trizol法提取組織總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度儀檢測RNA溶液的D260/D280比值，取比值在1.8～2.1者行下一步實驗。

1.3 反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR（qPCR）檢測miRNA-22

采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：16℃ 30 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min。miRNA-22 PCR擴增的上游引物序列為5-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3，下游引物序列為5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。同時選取U6 snRNA 為內(nèi)參照，實驗反復3次。U6內(nèi)參的上游引物5GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3，下游引物R：5CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3。RT-PCR結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt比較各樣品間miRNA-22的表達差異[2]，ΔCt=待檢樣品的miRNA-22 Ct值-該樣品的U6 Ct值，ΔΔCt值=食管癌組織的 ΔCt 值-癌旁組織的ΔCt值。

1.4 觀察指標

以食管癌組織中miRNA-22表達量的中位數(shù)為分界點將其分為低表達組和高表達組[3]，分析兩組與食管癌患者性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-22在食管癌及癌旁正常組織中的表達

經(jīng)qPCR技術(shù)檢測，食管癌組織中miRNA-22相對表達量為（3.51±1.05），明顯低于相應(yīng)正常癌旁組織的（11.23±2.95），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.831，P<0.05）。

2.2 miRNA-22的表達與食管癌臨床病理特征之間的關(guān)系

食管癌組織中miRNA-22表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miRNA-22的低表達率為94.4%（34/36），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的41.7%（5/12），Ⅳ期患者miRNA-22的低表達率為90.9%（10/11），明顯高于Ⅲ期患者的81.8%（18/22）和Ⅱ期患者的73.3%（11/15），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無顯著相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

3 討論

MicroRNA是一類長約20～22個核苷酸的小分子RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)約70 nt的miRNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成[4]，其通過與靶mRNA分子的3端非編碼區(qū)（3UTR）互補結(jié)合使目標mRNA分子受到翻譯水平調(diào)控或?qū)е缕浣到?，參與調(diào)控細胞生長分化、能量代謝、凋亡等生理過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞和正常細胞中的miRNA表達譜有明顯差異，約50%已知miRNA基因組定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點，通?？梢种颇[瘤細胞的表達[6]。

分子靶向治療是目前腫瘤治療的熱點，大多數(shù)靶向治療藥物主要針對與腫瘤相關(guān)的信號傳導通路中的某個重要分子，但由于細胞中存在著多種信號傳導通路，阻斷其中一個分子并不能完全起到抑制腫瘤細胞的作用。一個miRNA可以同時作用于多個靶基因，通過調(diào)控miRNAs的表達水平或可更廣泛地調(diào)控細胞中相關(guān)的信號傳導通路，取得更好的抗腫瘤效果。有些miRNA在腫瘤中低表達或不表達，可采用外源miRNA基因?qū)氙煼āＳ行﹎iRNA在腫瘤中高表達，可采用相應(yīng)的方法下調(diào)miRNA的表達。由此可見，尋找與腫瘤相關(guān)的miRNAs并明確其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用對腫瘤的治療具有重大意義。

2002年首次在慢性粒細胞白血病人群中發(fā)現(xiàn)，超過50%患者miRNA-15a和miRNA-16-l低表達或缺失[7]，此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中miRNA表達失調(diào)[8-14]。Feber等[15]比較了食管癌組織與正常上皮組織中miRNA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-203和miRNA-205在食管癌組織中的表達下調(diào)，而miRNA-21的表達上調(diào)。Tian等[16]研究指出miRNA-10b在食管癌細胞中表達失調(diào)，并通過調(diào)控KLF4 基因，參與食管癌的發(fā)生。Hiyoshi等[17]檢測20例食管癌及癌旁正常組織和7種食管癌細胞系中miRNA-21的表達，結(jié)果顯示：90%的癌組織miRNA-21表達上調(diào)，且與程序性細胞死亡基因4表達呈負相關(guān)。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-214在食管鱗癌中表達下調(diào)并與食管鱗癌的病理分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本實驗利用實時定量PCR技術(shù)，選擇miRNA-22作為研究對象，分析48例食管癌手術(shù)患者標本中癌組織與癌旁正常組織中miRNA-22的表達情況，并對臨床病理參數(shù)進行縱向比較，結(jié)果表明：食管癌組織中miRNA-22的相對表達量顯著低于癌旁正常組織（P<0.05）；食管癌組織中miRNA-22低表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期（Ⅲ+Ⅳ）間具有顯著相關(guān)性（P<0.05），提示miRNA-22在食管癌發(fā)生、發(fā)展中很可能具有抑癌基因的作用。因此，采用外源miRNA-22 基因?qū)牖蛑匦录せ羁赡艹蔀榭拱┲委熜碌难芯糠较颉?/p>

綜上所述，miRNA-22在食管癌組織中的表達下調(diào)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNA-22可能成為食管癌診斷及治療的新的分子標志。

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（收稿日期：2016-03-28）