韭菜遲眼蕈蚊抗藥性與4種酶活性關系研究

齊素敏 張宗營 張程程 莊乾營 張思聰 周仙紅 于毅 劉永杰

摘要：為了解山東省不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群抗藥性與乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）的活性關系，采用分光光度計法測定不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群AChE、GJSTs、CarE和ODM的活性。結果表明：泰安市、莘縣、壽光市、臨沭縣4個地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群的AChE、GSTs和ODM活性較相對敏感品系均有不同程度升高，相對比值分別為1.43-2.42、1.24-3.07和1.28-2.61，且與相對敏感品系相比差異顯著（P<0.05），CarE相對比值為1.02-1.20，多數(shù)種群與相對敏感品系無顯著性差異。說明AChE、CJSTs和ODM與韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關，其活性相對比值可作為韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的監(jiān)測指標。

關鍵詞：韭菜遲眼蕈蚊；抗藥性；酶活性

中圖分類號：S436.33

文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）02-0094-05

韭菜遲眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang），屬雙翅目眼蕈蚊科遲眼蕈蚊屬，是我國北方重要的蔬菜害蟲。韭菜遲眼蕈蚊生活周期短、繁殖力強，寄主范圍廣，可為害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫蘆科、傘形花科等7科30多種蔬菜，在江西、北京等地還為害食用菌。該蟲以幼蟲群集寄主根部蛀食，常造成韭菜缺苗斷壟，使韭菜減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，近年來發(fā)生有加重趨勢。目前，化學防治仍是控制韭菜遲眼蕈蚊的主要措施，隨著化學殺蟲劑的長期和大量使用，韭菜遲眼蕈蚊對常用殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性?？剐栽鰪娛罐r(nóng)藥使用效率降低，加大了防治難度。了解韭菜遲眼蕈蚊的抗藥性狀況，明確抗性種群的生化機制，可有針對性地采取防治措施，提高防治效果。乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）是韭菜遲眼蕈蚊體內(nèi)重要的靶標酶和解毒酶，與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生存在一定關系。目前，有關韭菜遲眼蕈蚊抗藥性與AChE、GSTs、CarE和ODM活性關系的研究未見報道。本研究通過對山東省不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊抗藥性與4種酶活性關系的研究，進一步明確AChE、GSTs、CarE和ODM與抗藥性產(chǎn)生的相關性，探討其生化特征作為韭菜遲眼蕈蚊抗藥性監(jiān)測指標的可行性，為有效治理該蟲提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

相對敏感種群：實驗室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多代的韭蛆，期間未接觸任何藥劑，作為本試驗相對敏感種群；

泰安種群：采自山東省泰安市邱家店鎮(zhèn)舊縣村小拱棚三年生韭菜地；

莘縣種群：采自山東省聊城市莘縣張寨鄉(xiāng)郭坊村小拱棚四年生韭菜地；

壽光種群：采自山東省壽光市化龍鎮(zhèn)埠西村小拱棚四年生韭菜地；

臨沭種群：采自山東省臨沂市臨沭縣曹莊鎮(zhèn)新華村小拱棚兩年生韭菜地。

每個地區(qū)種群均于2015年5月采集，室內(nèi)飼養(yǎng)一代，選取F1代供試。相對敏感種群和田間種群均選取個體大小較一致的健康3齡幼蟲做為供試蟲源。

1.2 供試藥劑

考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、GSTs測試盒、AChE測試盒、CarE測試盒，均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O），天津市凱通化學試劑有限公司。磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄·2H₂O），天津市凱通化學試劑有限公司。氫氧化鈉（NaOH），天津市凱通化學試劑有限公司。三氯甲烷（trichloromethane），天津市凱通化學試劑有限公司。對硝基苯酚（p-ni-trophenol），西亞試劑。還原型輔酶Ⅱ（NADPH），上海伯奧生物科技有限公司。對硝基苯甲醚（4-nitroanisole），分析純，Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶源制備 ①乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）酶源制備。挑取韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，準確稱重，按重量體積1∶9的比例加入生理鹽水，在碎冰中用玻璃勻漿器勻漿，2500r/min、4℃離心10min，取上清液作為酶源。

②羧酸酯酶（CarE）酶源制備。挑取韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，準確稱重，按重量體積1∶（5～10）的比例進行冰浴勻漿，15000r/min，4℃離心30min，取上清液作為酶源。

③細胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）酶源制備。挑取韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，準確稱重，按重量體積1∶9的比例加入0.05mol/L pH 7.8磷酸緩沖液，余同①。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍試劑盒進行測定。用標準蛋白（0.563g/L）作為標準。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶（AChE）活性測定 采用AChE試劑盒進行測定，方法步驟按照試劑盒說明書進行，重復3次。組織中AChE活力定義：每毫克組織蛋白在37℃保溫6min，水解反應體系中1μmol基質(zhì)為1個活力單位。計算公式：

AChE活力（U/mg prot）=（測定OD值-對照OD值）÷（標準OD值-空白OD值）×標準管濃度（1μmol/mL）÷樣本蛋白質(zhì)含量（mg prot/mL）

1.3.4 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活力測定采用GSTs試劑盒進行測定，方法步驟按照試劑盒說明書進行，重復3次。組織中GSTs活力單位定義：每毫克組織蛋白在37℃反應l min扣除非酶促反應，使反應體系中GST濃度降低1μmol/L為一個酶活力單位。計算公式：

GSTs活力（U/mg prot）=（對照OD值-測定OD值）÷（標準OD值-空白OD值）×標準管濃度（20μmol/L）×稀釋倍數(shù)（6倍）÷反應時間（10min）÷樣本取樣量（0.1mL）×勻漿液蛋白濃度（mg prot/mL）]

1.3.5 羧酸酯酶（CarE）活性測定 采用CarE試劑盒進行測定，方法步驟按照試劑盒說明書進行，重復3次。按樣本質(zhì)量計算，組織勻漿中CarE的活力定義：每克組織在37℃每分鐘催化吸光值增加1，定義為1U。計算公式：

CarE活力（U/g）=67×（△A測定管-△A空白管）÷樣本質(zhì)量（g）

1.3.6 細胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）比活力測定參考Hansen等的方法。稱取一定量對硝基苯酚，將對硝基苯酚溶解在NaOH溶液中，配成梯度濃度對硝基苯酚的NaOH溶液，在400nm下比色，做出標準曲線。X軸為對硝基苯酚的量，Y軸為OD值。反應總體系2mL：O.1mol/LpH7.8的磷酸緩沖液1270μL，0.36 mmol/LNADPH 200μL，3mmol/L對硝基苯甲醚30μL，酶液500μL。反應體系在25℃振蕩溫育反應30min，加入0.5mL lmol/L HCl終止反應，再加入2.5mL三氯甲烷萃取反應產(chǎn)物對硝基苯酚，在3000r/min下離心15min。取下層即三氯甲烷層1.5mL加入1.5mL O.5mol/L NaOH反萃取。NaOH萃取液在400nm比色分析，重復3次，得到OD值，以0.5mol/L NaOH溶液為對照。然后根據(jù)對硝基苯酚標準曲線和每毫升酶液中所含蛋白的量求出每分鐘每毫克蛋白產(chǎn)生的對硝基苯酚摩爾數(shù)來表示酶活性[μmol/（min·mg）]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.O數(shù)據(jù)處理軟件和Microsoft Excel 2010表格軟件分析、處理。

2 結果與分析

2.1 AChE活性

不同地區(qū)種群韭菜遲眼蕈蚊乙酰膽堿酯酶（AChE）活性比較結果（表1）顯示，4個不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群AChE活性較相對敏感品系均有不同程度提高，與相對敏感種群的活性比值由高到低分別是莘縣、泰安、壽光和臨沭種群，分別為2.42、2.27、2.11和1.43倍。4個韭菜遲眼蕈蚊田間種群AChE活性與相對敏感品系AChE活性差異顯著。

2.2 GSTs活性

不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性比較結果（表1）顯示，4個韭菜遲眼蕈蚊種群GSTs活性較相對敏感品系均有不同程度提高，莘縣種群的GST活性最高，是相對敏感品系的3.07倍；泰安和壽光種群的GST活性次之，分別為相對敏感品系的2.39和1.82倍；而臨沭種群相對比值是相對敏感品系的1.24倍，活性最低。4個韭菜遲眼蕈蚊田間種群與相對敏感品系GSTs活性均有顯著性差異。

2.3 CarE活性

不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群羧酸酯酶（CarE）活性比較結果（表1）顯示，4個韭菜遲眼蕈蚊田間種群CarE活性較敏感品系略有升高，泰安種群的CarE活性最高，是相對敏感品系的1.20倍，其它3個韭菜遲眼蕈蚊品系酶活性與相對敏感品系酶活性比值在1.02和1.06之間。4個韭菜遲眼蕈蚊田間種群CarE活性變化幅度較小，僅泰安種群CarE活性與相對敏感品系有顯著性差異。

2.4 0DM活性

不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群細胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）活性比較結果（表1）顯示，4個韭菜遲眼蕈蚊種群ODM活性較相對敏感品系均有不同程度提高，莘縣種群的ODM活性最高，是相對敏感品系的2.61倍，壽光和泰安種群的ODM活性次之，分別為相對敏感品系的1.50和1.47倍，這3個韭菜遲眼蕈蚊田間種群與相對敏感品系ODM活性有顯著性差異；而臨沭種群ODM活性相對比值是相對敏感品系ODM活性的1.28倍，兩者無顯著性差異。

3 結論與討論

筆者已研究了泰安市、莘縣、壽光市、臨沭縣韭菜遲眼蕈蚊種群對6種殺蟲劑的抗藥性水平（另文），結果顯示4個不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群對毒死蜱、辛硫磷、高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯等常用藥劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。對有機磷類藥劑毒死蜱和辛硫磷，泰安、莘縣和壽光種群均產(chǎn)生了中等水平的抗性，莘縣種群抗性分別為30.47和24.05倍，泰安種群的抗性為19.67和25.69倍，壽光種群的抗性為15.97和17.80倍；莘縣種群對菊酯類藥劑高效氯氰菊酯也產(chǎn)生了中等水平的抗性，抗性為11.45倍。4個不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群中，臨沭種群抗性最低，對毒死蜱和辛硫磷產(chǎn)生了低等抗藥性，對兩種菊酯類藥劑還處于敏感狀態(tài)。

乙酰膽堿酯酶（AChE）是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標，靶標敏感性降低是昆蟲抗藥性產(chǎn)生涉及的主要機制之一。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，研究表明，害蟲抗藥性的增強與殺蟲劑代謝相關的解毒酶活性的增強有關，而不同的解毒酶對不同殺蟲劑的抗性發(fā)展作用不同。研究結果顯示，4個不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群AChE活性較敏感品系均有顯著性差異，說明AChE作為靶標酶參與了韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的形成。莘縣種群對毒死蜱的抗性水平最高，其AChE的活性比值也最高，說明韭菜遲眼蕈蚊對常用藥劑的抗性與AChE活性具有正相關性。由此推斷，抗性韭菜遲眼蕈蚊AChE過高的表達量可能導致了其AChE敏感性的降低。具有抗性的田間種群GSTs和ODM活性較敏感品系有明顯升高，說明解毒酶GSTs、ODM活性增高是導致抗性產(chǎn)生的原因之一，抗性監(jiān)測和酶活試驗結果比較發(fā)現(xiàn)，抗性水平最高的莘縣韭菜遲眼蕈蚊種群，其GSTs、ODM活性也較高，泰安、壽光種群抗性水平較低，其GSTs、ODM活性較前者略低，抗藥性和酶活性具有一定的正相關性，進一步證明了GSTs及ODM作為韭菜遲眼蕈蚊體內(nèi)解毒酶，其活性高低與韭菜遲眼蕈蚊的抗藥性水平密切相關。據(jù)報道，CarE活性的改變，是多種昆蟲產(chǎn)生抗藥性的重要生化因素之一，但本研究發(fā)現(xiàn)，田間韭菜遲眼蕈蚊種群CarE活性與相對敏感品系相比略有升高，4個種群中有3個種群CarE活性同相對敏感品系差異不顯著，說明韭菜遲眼蕈蚊CarE活性的變化與抗藥性水平無明顯相關性。

韭菜遲眼蕈蚊田間種群與相對敏感種群AChE、GSTs和ODM活性上的差異表明AChE、GSTs和ODM與韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的產(chǎn)生密切相關，AChE、GSTs和ODM活性相對比值可作為韭菜遲眼蕈蚊對常用藥劑抗性的監(jiān)測指標。CarE與抗藥性的關系不密切，其活性相對比值僅能作為韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的參考指標。然而，對抗性韭菜遲眼蕈蚊酶活性測定的工作尚不全面，磷酸酯酶、超氧化物歧化酶等與昆蟲抗藥性有關的酶活性測定都未進行，這些酶活性與韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的關系有待于進一步研究和探討。