枯草芽孢桿菌對(duì)韭菜遲眼蕈蚊生長(zhǎng)發(fā)育及代謝活動(dòng)的影響

高歡歡 葛溫伯 覃冬云 于毅

摘要：韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(chóng)又稱韭蛆，是韭菜等多種蔬菜上的主要害蟲(chóng)，化學(xué)防治作為其主要的防治方法，造成嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問(wèn)題。為了明確枯草芽孢桿菌對(duì)韭菜遲眼蕈蚊的作用，進(jìn)一步尋找防治韭蛆的新方法，本研究利用枯草芽孢桿菌侵染不同蟲(chóng)態(tài)的韭菜遲眼蕈蚊，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況以及韭蛆體內(nèi)代謝酶活性的變化。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)韭菜遲眼蕈蚊卵孵化率、蛹羽化率及成蟲(chóng)產(chǎn)卵量均無(wú)顯著影響，但韭蛆對(duì)其反應(yīng)較為敏感，存活率顯著下降。四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)代謝物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌侵染后，其體內(nèi)的海藻糖、蛋白質(zhì)含量及脂肪酶活性均無(wú)顯著變化；纖維素酶活性顯著提高；幾丁質(zhì)酶、a-淀粉酶、堿性磷酸酶的活性顯著或極顯著降低，這與韭蛆存活率下降和壽命縮短有一定相關(guān)性。因此，枯草芽孢桿菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)韭蛆體內(nèi)部分代謝酶的活性來(lái)影響其生長(zhǎng)發(fā)育，為韭蛆的防治提供新方法。

關(guān)鍵詞：韭菜遲眼蕈蚊；枯草芽孢桿菌；生長(zhǎng)發(fā)育；代謝酶活性；防治方法

中圖分類號(hào)：S436.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）02-0089-05

韭菜遲眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang）屬雙翅目、長(zhǎng)角亞目、眼蕈蚊科、遲眼蕈蚊屬。其幼蟲(chóng)又稱韭蛆，取食范圍十分廣泛，可為害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫蘆科、傘形科等多種蔬菜，尤其是韭菜，致使其產(chǎn)量損失嚴(yán)重。韭蛆危害分布非常廣泛，全國(guó)各地均有發(fā)生，除中國(guó)以外，中東、歐洲、北美以及東亞其他地區(qū)也有發(fā)生。在韭蛆的防治方面，化學(xué)防治仍然是目前最有效的方法，但農(nóng)藥的持續(xù)使用已經(jīng)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、土壤污染以及抗藥性等多種問(wèn)題的產(chǎn)生，因此，低毒高效的綜合防治方法是防治韭蛆危害亟需解決的問(wèn)題。

韭蛆具有鉆蛀性，韭菜根部受到危害后易腐爛，同時(shí)滋生大量微生物。高歡歡等從韭蛆體內(nèi)，韭菜鱗莖、根部及其周圍土壤中分離出25種微生物，其中枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis在韭蛆和韭菜體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)?？莶菅挎邨U菌作為一種腸道微生物已在多種昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其菌體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等多種活性物質(zhì)，對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。a-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)物質(zhì)代謝必不可少的酶；韭菜遲眼蕈蚊以取食韭菜為主，韭菜中纖維素的降解和利用離不開(kāi)纖維素酶；幾丁質(zhì)酶作為蛻皮和變態(tài)過(guò)程中的重要酶類，在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用；堿性磷酸酯酶在生物體中直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過(guò)程，是生物體內(nèi)一種重要的調(diào)控酶，對(duì)昆蟲(chóng)的防御體系以及滯育時(shí)間有調(diào)控作用。

本研究通過(guò)枯草芽孢桿菌侵染，觀察韭菜遲眼蕈蚊生長(zhǎng)發(fā)育的變化規(guī)律以及韭蛆體內(nèi)a-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和堿性磷酸酯酶活性的變化，從而明確枯草芽孢桿菌對(duì)韭菜遲眼蕈蚊生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活動(dòng)的影響，為韭蛆的防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源 韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(chóng)飼養(yǎng)于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室，溫度為（25±1）℃，濕度為（70±5）%，光周期為16L：8D。取不同發(fā)育時(shí)期（卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)）的韭菜遲眼蕈蚊用于試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與試劑 超凈工作臺(tái)（SW-Cj-ZFD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；培養(yǎng)箱（RXZ-328A型，寧波江南儀器廠）；離心機(jī)（D-78532，德國(guó)Tuttlingen）；紫外分光光度計(jì)（EMax Plus微孔板讀板機(jī)，美國(guó)美谷分子）；搖床（HY-6A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器，常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠）。

NB培養(yǎng)基，0.01% PBS緩沖液，2%瓊脂，BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒、脂肪酶活性試劑盒、海藻糖含量試劑盒、植物a-淀粉酶試劑盒、纖維素酶活性測(cè)定試劑盒、組織及血液堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒、幾丁質(zhì)酶試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌活化枯草芽孢桿菌菌株保存于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治實(shí)驗(yàn)室，在NB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，重新活化。挑取單菌落過(guò)夜搖菌，經(jīng)稀釋和紫外分光光度計(jì)測(cè)定后，取OD值為1的菌懸液用于試驗(yàn)。

1.2.2 韭菜遲眼蕈蚊卵孵化率及韭蛆壽命試驗(yàn)

在鋪有10mL瓊脂和兩層濾紙的培養(yǎng)皿中輕輕挑入100枚韭菜遲眼蕈蚊的卵，對(duì)照組用無(wú)菌PBS溶液浸泡卵30min，處理組用OD值為1的枯草芽孢桿菌懸浮液浸泡卵30min，每組10個(gè)重復(fù)。取同等大小的韭菜段用75%酒精消毒并用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗后晾干，處理組經(jīng)菌液浸泡30s后置于相應(yīng)培養(yǎng)皿中，對(duì)照組以PBS緩沖液浸泡代替。處理后的卵放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察卵的孵化情況，孵化后記錄韭蛆的死亡數(shù)量，用于韭蛆壽命的觀察試驗(yàn)。

1.2.3 二齡、三齡、四齡韭蛆存活率及體重試驗(yàn)

分別取同日齡的韭蛆二齡、三齡和四齡幼蟲(chóng)，用5%次氯酸鈉溶液消毒并清洗，針扎每個(gè)幼蟲(chóng)的腹部末端（二齡幼蟲(chóng)體型較小，未經(jīng)過(guò)針刺處理，以避免死亡率過(guò)大，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性），處理組用枯草芽孢桿菌懸浮液浸泡30min，對(duì)照組用PBS緩沖液代替。處理后用細(xì)毛筆輕輕挑人鋪有10mL瓊脂和兩層濾紙的培養(yǎng)瓶中，同時(shí)放人消毒處理過(guò)的韭菜段（處理方法同上），每組每個(gè)蟲(chóng)齡均設(shè)10個(gè)重復(fù)，共60個(gè)培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶50頭幼蟲(chóng)。處理后的韭蛆放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后觀察韭蛆死亡數(shù)量，將存活的韭蛆收集后稱重。四齡幼蟲(chóng)保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 蛹羽化率試驗(yàn)蛹除無(wú)需針刺以外，其他處理方式與幼蟲(chóng)相同，枯草芽孢桿菌處理組和對(duì)照組均設(shè)置10個(gè)重復(fù)，處理后的蛹放人培養(yǎng)箱中，每日觀察羽化情況直至所有的蛹羽化完成。

1.2.5 成蟲(chóng)產(chǎn)卵量試驗(yàn)分別取20對(duì)無(wú)菌狀態(tài)下飼養(yǎng)的成蟲(chóng)置于鋪有10mL瓊脂和兩層濾紙的培養(yǎng)瓶中，同時(shí)放人消毒處理過(guò)的韭菜段（處理方法同上），每組10個(gè)重復(fù)。處理后的成蟲(chóng)放人培養(yǎng)箱中，每日更換培養(yǎng)瓶，記錄培養(yǎng)瓶中卵的數(shù)量，直至成蟲(chóng)死亡。

1.2.6 四齡韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)、海藻糖含量及5種代謝酶活性的測(cè)定從-80℃冰箱中取出保存的四齡幼蟲(chóng)，枯草芽孢桿菌處理組和對(duì)照組分別10個(gè)重復(fù)，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定幼蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖的含量以及5種代謝酶的活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)分析所用軟件為SPSS 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)卵孵化率、韭蛆壽命、蛹羽化率和成蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響

由表1可知，與對(duì)照相比，枯草芽孢桿菌處理的卵孵化率和蛹羽化率有所下降，成蟲(chóng)產(chǎn)卵量上升，但差異均不顯著；而韭蛆壽命則受到枯草芽孢桿菌的顯著影響（F=4.75，P=0.04），與對(duì)照相比，明顯下降。說(shuō)明枯草芽孢桿菌對(duì)韭菜遲眼蕈蚊卵、蛹和成蟲(chóng)不會(huì)造成顯著影響，幼蟲(chóng)階段則較為敏感。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)韭蛆體重和存活率的影響

由表2可知，二齡幼蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)平均體重在枯草芽孢桿菌侵染后變化不顯著，三齡幼蟲(chóng)平均體重則極顯著下降（F=13.17，P=0.002）。

由圖1可知，二齡、三齡、四齡幼蟲(chóng)存活率均受到枯草芽孢桿菌的顯著影響。其中二齡幼蟲(chóng)（F=4.88，P=0.042）和四齡幼蟲(chóng)（F=7.80，P=0.013）的存活率在枯草芽孢桿菌侵染后顯著下降。三齡幼蟲(chóng)對(duì)照組和枯草芽孢桿菌處理組的存活率均較低，其中對(duì)照條件下的存活率為（61.11±6.07）%，處理組卻顯著上升到（77.11+2.63）%（F=5.86，P=0.028），由此，枯草芽孢桿菌降低了三齡韭蛆的平均體重并使其存活率有所上升，二齡和四齡幼蟲(chóng)的平均體重雖沒(méi)有顯著變化，但存活率顯著下降。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)四齡韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)、海藻糖含量的影響

由表3可知，四齡韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖含量在枯草芽孢桿菌侵染后均有所波動(dòng)，其中蛋白質(zhì)含量降低，海藻糖含量升高，但差異均不顯著。因此，枯草芽孢桿菌對(duì)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、海藻糖含量并沒(méi)有造成顯著影響。

2.4 枯草芽孢桿菌對(duì)四齡韭蛆體內(nèi)5種代謝酶活性的影響

由圖2可知，枯草芽孢桿菌對(duì)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的纖維素酶、a-淀粉酶、堿性磷酸酯酶、幾丁質(zhì)酶活性有顯著或極顯著影響。其中纖維素酶的活性在枯草芽孢桿菌侵染后顯著升高（F=18.63，P=0.012）；a-淀粉酶酶活性極顯著降低（F=13.97，P=0.007）；堿性磷酸酯酶受影響最大，與對(duì)照相比，酶活性降低了74.26%（F=23.78，P=0.005）；脂肪酶活性在受到枯草芽孢桿菌侵染后有所上升，但差異并不顯著（F=3.26，P=0.11）；而幾丁質(zhì)酶則受到枯草芽孢桿菌的顯著影響（F=7.30，P=0.036），活性顯著下降。由此，枯草芽孢桿菌的侵染沒(méi)有引起四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酶活性的顯著變化，而幾丁質(zhì)酶作為蛻皮和變態(tài)過(guò)程中的重要酶類，活性顯著下降，這與韭蛆壽命的變化一致。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)韭菜遲眼蕈蚊卵、蛹和成蟲(chóng)均沒(méi)有顯著影響，這是因?yàn)榫虏诉t眼蕈蚊的卵有卵殼包被作為保護(hù)層，而蛹時(shí)期表皮中幾丁質(zhì)含量高，有效阻止了外源物質(zhì)的侵染，因此韭菜遲眼蕈蚊在未孵化前以及進(jìn)入蛹期后很難進(jìn)行防治。進(jìn)入成蟲(chóng)階段后，韭菜遲眼蕈蚊取食量非常小，壽命較短，取食外源物質(zhì)并不能顯著改變其產(chǎn)卵量。而枯草芽孢桿菌對(duì)韭蛆幼蟲(chóng)的存活率和體重影響較為顯著，二齡和四齡幼蟲(chóng)的存活率顯著下降，三齡幼蟲(chóng)體重顯著下降，但存活率有所升高。這可能是因?yàn)槿g階段是韭蛆危害較為嚴(yán)重的時(shí)期，取食量大，代謝活性較強(qiáng)，對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生了一定耐受力，但其是否與枯草芽孢桿菌形成了協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系則需要進(jìn)一步研究。

本研究選擇了發(fā)育歷期最長(zhǎng)、代謝活動(dòng)最為復(fù)雜的四齡幼蟲(chóng)作為研究對(duì)象進(jìn)行代謝物質(zhì)和酶活性的檢測(cè)，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌侵染后，韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖含量以及脂肪酶的活性并沒(méi)有受到顯著影響，而纖維素酶的活性顯著提高。幾丁質(zhì)在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的每個(gè)階段都必須維持在一定水平內(nèi)，過(guò)多或缺失都將對(duì)昆蟲(chóng)造成致命影響，參與糖類代謝的a-淀粉酶以及參與幾丁質(zhì)代謝的幾丁質(zhì)酶在枯草芽孢桿菌侵染后顯著降低，同時(shí)韭蛆的壽命縮短和存活率下降，說(shuō)明枯草芽孢桿菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)韭蛆體內(nèi)a-淀粉酶和幾丁質(zhì)酶的活性來(lái)影響其生長(zhǎng)發(fā)育。另外，堿性磷酸酯酶作為一種具有抗逆作用的酶，在昆蟲(chóng)受到外界刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性的變化，以維持體內(nèi)物質(zhì)代謝的平衡，枯草芽孢桿菌侵染后，韭蛆體內(nèi)堿性磷酸酯酶的活性降低幅度最大，達(dá)到74.26%，說(shuō)明堿性磷酸酯酶對(duì)枯草芽孢桿菌反應(yīng)較為敏感。

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，枯草芽孢桿菌目前主要應(yīng)用于病害的防治研究，在昆蟲(chóng)防治方面應(yīng)用較少。本研究通過(guò)枯草芽孢桿菌對(duì)韭蛆的侵染，發(fā)現(xiàn)其改變了韭蛆體內(nèi)代謝酶的活性，進(jìn)而對(duì)韭蛆的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了不利影響。但若單獨(dú)用枯草芽孢桿菌防治韭蛆，則效果有限，因此可以作為增效劑，結(jié)合其他防治方法共同防治韭蛆，其效用如何還需進(jìn)一步研究。