花生ABI3基因的克隆、序列分析及表達(dá)載體構(gòu)建

王云云 孫全喜 王秀貞 唐月異 吳琪 張青云 曹廣英 祁雪 張君 王傳堂

摘要：脫落酸（ABA）作為植物體內(nèi)的一種重要激素，參與植物多個生長發(fā)育過程。ABI3是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因。本研究采用RT-PCR技術(shù)從花生成熟種子中克隆到ABI3的同源基因AhABI3。預(yù)測該基因開放閱讀框為2313 bp，編碼770個氨基酸。同源比較發(fā)現(xiàn)AhABI3與擬南芥、鷹嘴豆等的ABI3具有較高的相似性；進(jìn)化分析表明AhABI3與鷹嘴豆ABI3親緣關(guān)系最近。本研究還成功構(gòu)建了AhABI3的過量表達(dá)載體pCambia2300EC-AhABI3，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；AhABI3；進(jìn)化樹分析；氨基酸比對；植物表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類號：S565.201

文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）02-0001-06

花生（Arachis hypogaea L.）是一種豆科植物，其種植面積排在稻谷、小麥、玉米、大豆、油菜和甘薯之后，列第七位，在油料作物中，其種植面積僅次于油菜?；ㄉ鳛槲覈匾挠土虾徒?jīng)濟(jì)作物，在油料生產(chǎn)和國際貿(mào)易中占有舉足輕重的地位，與油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的單產(chǎn)、總產(chǎn)量和出口量均居首位。

脫落酸（ABA）作為植物體內(nèi)的一種重要激素，參與植物多個生長發(fā)育過程，如抑制種子萌發(fā)、促進(jìn)休眠、抑制生長、促進(jìn)葉片衰老脫落等。ABI3基因是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因，在調(diào)節(jié)種子成熟、萌發(fā)等生長過程中起著重要作用。

擬南芥ABI3在種子成熟過程中起著主要調(diào)節(jié)作用。玉米VP1基因與擬南芥ABI3基因在氨基酸序列水平上有較高的相似性，它能使種子早熟，抑制胚胎和糊粉層中花青素積累。ABI3/VP1的同源基因也已在其他植物中發(fā)現(xiàn)，如水稻、菜豆、燕麥、胡蘿卜、白楊等，這些基因編碼的蛋白序列的高度保守性表明該轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控開花植物的胚成熟過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Giraudat等對ABI3和VP1蛋白序列的分析發(fā)現(xiàn)了3個高度保守區(qū)域，從氨基端分別命名為B1、B2和B3。從玉米VPI中分離出其B3結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)它在體外可以與C1基因啟動子上的Sph基序（含有RY元件）特異性地結(jié)合。郭曉芳等通過Northern雜交技術(shù)檢測到ABI3同源基因在花生種子的子葉和胚中表達(dá)，但是沒有對該基因進(jìn)行克隆。

本研究從花生“X-166”成熟種子中克隆到AB13的同源基因AhABI3，經(jīng)同源比對和進(jìn)化樹分析，AhABI3與來自其它物種的ABI3有較高的同源性；構(gòu)建了AhABI3的過量表達(dá)載體pCam-bia2300EC-AhABI3，旨在研究該基因在花生中的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料及載體

試驗所用“X-166”花生種子由山東省花生研究所提供；植物表達(dá)載體pCambia2300EC（添加了35S啟動子以及Tnos終止子的pCambia2300載體）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)元寶秀教授饋贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 AhAB13基因序列的獲得及PCR擴增 利用擬南芥ABI3 mRNA序列（GenBank登錄號：NC_003074.8）在花生基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.peanutbase.org）中進(jìn)行BLAST，獲得可能的花生AhABI3序列（PU48P.1）。根據(jù)預(yù)測基因的開放閱讀框（ORF），用DNAClub設(shè)計引物F1、R1（表1）。

提取花生種子總RNA，用ReverAid FirstStrand cDNA Svnthesis Kit（Fermentas）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA，利用引物F1、R1對該基因的開放閱讀框進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系：5×HF Buffer 10 μL， dNTP Mix（10 mmol/L）2μL，引物F1 2μL，引物R1 2μL，DMS0 0.6μL，高保真酶Phusion（New England Labs）0.2μL，模板1μL，ddH₂O32.2μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃后延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，切取含目的條帶的凝膠，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt simple載體（北京全式金）連接、熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a（北京全式金），取陽性克隆送上海桑尼生物科技有限公司測序，將測序正確的克隆命名為pEASY-AhABI3-1。

1.2.2 AhABI3基因序列和氨基酸序列分析 基因開放閱讀框、氨基酸序列比對由DNAMAN序列分析軟件（Lvnnon Biosoft）完成。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將AhABI3編碼的氨基酸序列與來自其它物種的ABI3氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并使用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 植物過量表達(dá)載體的構(gòu)建 參照質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明步驟，提取pEASY-AhABI3-1和pCambia2300EC質(zhì)粒。用DNAClub設(shè)計含Kpn I（Fermentas）和Sac I（Fermentas）酶切位點的引物F2、R2（表1），對pEASY-AhABI3-1質(zhì)粒稀釋物進(jìn)行PCR擴增。得到的片段連接克隆載體pEASY-bluntsimple后，得到質(zhì)粒pEASY-AhAB13-2，利用Kpn I和Sac 1分別對其和植物表達(dá)載體pCam-bia2300EC進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，使用連接酶Solution I（大連寶生物）16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，挑取單菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定并測序，獲得帶有AhABI3的植物表達(dá)載體pCambia2300EC-AhABI3.

2 結(jié)果與分析

2.1 花生總RNA的提取

將提取的花生種子RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），可見28S和18S條帶清晰完整，表明所提RNA質(zhì)量較好，可用于下一步試驗。

2.2 AhABI3基因的克隆

以RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，利用設(shè)計的引物F1、R1進(jìn)行PCR擴增，獲得大小約為2300 bp的片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。將測序結(jié)果利用DNAMAN軟件分析得到長度為2313bp的ORF，編碼770個氨基酸（圖3）。

2.3 AhABI3氨基酸序列分析

將推導(dǎo)的AhABI3氨基酸序列與來自其它5個物種的ABI3氨基酸序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列比對結(jié)果顯示AhABI3與鷹嘴豆ABI3序列的同源度較高，與擬南芥等其它物種的ABI3存在一定的同源性，其中，B3結(jié)構(gòu)域有很高的相似性（圖4）。由此推斷，AhABI3應(yīng)為ABI3的同源基因。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示AhABI3與鷹嘴豆ABI3親緣關(guān)系較近（圖5）。

2.4 AhABI3基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

對帶有目的基因片段的克隆載體pEASY-AhABI3-2和植物表達(dá)載體pCambia2300EC同時用Kpn I和Sac I進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果見圖6，回收目的片段以及載體片段，連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)菌液PCR后，挑取陽性克隆測序，測序結(jié)果表明AhABI3片段已準(zhǔn)確插入到植物表達(dá)載體pCambia2300EC上，載體結(jié)構(gòu)見圖7。

3 討論

種子休眠的建立與維持與脫落酸ABA密切相關(guān)。在野生型擬南芥種子中，ABA的累積誘導(dǎo)種子進(jìn)入休眠，并維持休眠狀態(tài)。ABA不敏感突變體（abil和abi2）種子表現(xiàn)為輕度休眠，在萌發(fā)過程中對ABA抑制萌發(fā)的敏感性降低；而ABA敏感性增強突變體表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)所需ABA量的降低。這表明對于維持種子的休眠性，種子中ABA含量以及對ABA的敏感性均起著重要作用。

ABA生物合成基因的過量表達(dá)會使種子中ABA含量增加，從而促進(jìn)種子休眠或延遲萌發(fā)。陳靜等研究顯示，休眠花生種子在吸脹過程中，為了維持種子休眠性，ABA合成關(guān)鍵基因AhNCED2的表達(dá)量增加，吸脹18h時達(dá)到峰值，隨即開始下降。ABI3轉(zhuǎn)錄因子在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中是必不可少的，這暗示AhABI3基因可能與花生種子休眠有關(guān)。本研究克隆得到AhABI3基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析，認(rèn)為其是ABI3基因的同源基因，并成功構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCambia2300EC-AhABI3，為進(jìn)一步研究AhABI3基因的功能奠定了基礎(chǔ)。