A型口蹄疫病毒結構蛋白VP1的原核表達、純化及鑒定

顏健華 何奇松 蔣家霞 馮淑萍 黃勝斌 韋達有 易春華 許瑞勝 梁晟 熊毅

摘要：【目的】通過原核表達及純化獲得A型口蹄疫病毒（FMDV）結構蛋白VP1，為建立A型FMDV的ELISA診斷方法及開發(fā)安全、高效、廣譜的新型基因工程疫苗提供技術支持?！痉椒ā恳院珹型FMDV VP1基因的重組質粒pMD18- T-A-VP1為模板，通過特異性引物擴增A型FMDV的VP1基因，構建表達質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1，然后轉入感受態(tài)細胞E. coli BL21（DE3）中誘導表達融合蛋白。【結果】誘導表達獲得的VP1融合蛋白主要以包涵體形式存在，分別經(jīng)His·Bind和GST·Bind柱層析純化，SDS-PAGE分析結果表明融合蛋白純度較高；Western blotting檢測分析發(fā)現(xiàn)，VP1融合蛋白能與豚鼠抗A型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結合，但不與豚鼠抗O型和Asia1型FMDV陽性血清反應。【結論】經(jīng)原核表達及純化獲得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特異性和抗原性，可用于易感動物的免疫及血清抗體篩查。

關鍵詞： A型FMDV；VP1蛋白；原核表達；純化；鑒定

中圖分類號： S852.659.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0301-05

0 引言

【研究意義】口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種高度接觸性A類動物傳染?。⊿obrino et al.，2001）。FMDV屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）、口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），其完整病毒顆粒包括衣殼和RNA兩部分，組成病毒粒子衣殼的主要結構蛋白有4種，分別為VP1、VP2、VP3和VP4，其中暴露于病毒粒子表面的VP1結構蛋白不僅是主要抗原位點存在區(qū)，還是病毒受體結合區(qū)，為誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要成分（Collen et al.，1991）。FMDV可分為O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型等7個血清型，不同血清型間無交叉免疫反應（Pereira，1977；Domingo et al.，2003）。我國的O型、A型及Asia1型呈交替流行趨勢，且涉及面廣、疫情復雜、破壞性強（劉暢等，2013）。因此，針對當前FMD疫情的復雜性，有必要建立快速、有效、穩(wěn)定的檢測方法，為其診斷和防控提供技術支持。【前人研究進展】A型FMD于1964年從前蘇聯(lián)傳入我國新疆地區(qū)（劉在新等，1998），但之后并未發(fā)生大規(guī)模流行；直至2009年在湖北武漢暴發(fā)A型FMD，同年在上海、山東、江蘇、廣西、貴州和新疆6個省（區(qū)）也有A型FMD暴發(fā)的報道，2010年在韓國也同樣出現(xiàn)A型FMD（劉在新等，1998；Bai et al.，2011；Tamura et al.，2011；Abdul-Hamid et al.，2011）。Knowles等（2012）報道，近年來東南亞國家流行的A型FMD是繼O型和Asia1型之后再次引起東亞地區(qū)的暴發(fā)流行。2013年3月廣東茂名某豬場出現(xiàn)A型FMD臨床發(fā)病病例，之后在我國部分地區(qū)開始流行。裴仉福等（2004）對牛源A型FMDV結構蛋白VP1基因進行克隆及表達，發(fā)現(xiàn)VP1基因在大腸桿菌中能高效表達，且能被A型FMDV陽性血清識別。李菁等（2010）、劉暢等（2013）也研究發(fā)現(xiàn)，VP1重組蛋白能夠被A型FMDV陽性血清特異性識別，為深入研究結構蛋白VP1在FMDV致病機制中的作用奠定了基礎。【本研究切入點】鑒于A型FMD近年來的流行趨勢，有必要對A型FMD進行深入研究，制備出針對VP1單克隆抗體的診斷試劑盒，為有效防控A型FMD提供參考依據(jù)。【擬解決的關鍵問題】通過原核表達及純化獲得A型FMDV結構蛋白VP1，并鑒定其特異性，以期為建立A型FMD的ELISA診斷方法及開發(fā)安全、高效、廣譜的新型基因工程疫苗提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

原核表達載體pET-32a、pGEX-6p-1及含A型FMDV VP1基因的重組質粒pMD18-T-A-VP1由廣西動物疫病預防控制中心保存提供；T4 DNA連接酶、限制性內切酶、Ex Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗豚鼠IgG抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，豚鼠抗A型FMDV陽性血清購自中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所。

1. 2 引物設計與合成

根據(jù)原核表達載體及目的基因序列設計1對針對完整VP1基因（639 bp）的特異性引物E1（5'-CCG

GAATTCACCACCACTGTTGAGAACTACG-3'）和E2

（5'-CCGCTCGAGTCATTACAGGAGTTGCTTTGCA

GGTGC-3'），并插入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點（下劃線部分）。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 VP1重組表達載體的構建

以測序正確的重組質粒pMD18-T-A-VP1為模板，用引物E2/E3擴增VP1基因，回收其目的基因。用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，同時雙酶切處理原核表達載體pET-32a和pGEX-6p-1，將目的基因酶切回收產(chǎn)物與表達載體酶切回收產(chǎn)物進行連接、轉化感受態(tài)細胞E. coli BL21（DE3），提取重組質粒后，分別對陽性重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1進行鑒定。

1. 4 VP1重組菌的誘導表達

對陽性重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的菌液進行復蘇，于37 ℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)過夜。然后分別取復蘇菌液500 μL加入到兩管含10 mL氨芐西林（Amp）的LB培養(yǎng)液中，37 ℃下斜搖（200 r/min）培養(yǎng)，待菌液OD值達0.4～0.6時，其中一管加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導菌液表達蛋白，另外一管不加IPTG作空白對照，于37 ℃下繼續(xù)直搖（200 r/min）培養(yǎng)4～6 h，以SDS-PAGE和Western blotting檢測重組菌蛋白的表達情況。

1. 5 VP1重組菌表達形式的確定

取誘導表達后的菌液30 mL，10000×g離心10 min，棄上清液；用PBS洗滌重組菌沉淀，重復洗滌3次；加入20 mL PBS重懸重組菌沉淀，反復凍融3次后，在冰浴中超聲波裂解（先超聲波裂解3 s，間歇5 s振幅30%，再超聲波裂解30 min）；經(jīng)10000×g離心10 min后分別收集沉淀和上清液，并以SDS-PAGE分析重組菌表達蛋白形式。若表達蛋白存在于上清液中，即為可溶性蛋白；存在于沉淀中，則為包涵體形式。

1. 6 VP1融合蛋白的純化

利用His·Bind柱層析純化法對融合蛋白pET-32a- VP1進行純化，以GST·Bind柱層析純化法對融合蛋白pGEX-6p-1-VP1進行純化，最后采用SDS-PAGE分析目的蛋白的純化情況。

1. 7 純化融合蛋白鑒定

采用Western blotting對純化的融合蛋白進行鑒定，其一抗分別使用豚鼠抗A型、O型和Asia1型FMDV陽性血清，酶標二抗使用山羊抗豚鼠血清IgG-HRP。

2 結果與分析

2. 1 VP1重組表達載體

以重組質粒pMD18-T-A-VP1為模板，用特異性引物E2/E3擴增得到的VP1基因大小為639 bp，與預期結果一致（圖1）。將該目的片段克隆至pET-32a和pGEX-6p-1原核表達載體后，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，結果顯示目的片段與預期結果一致（圖2）；測序分析結果顯示重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1均含有編碼正確的讀碼框（圖3）。

Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant bacteria E. coli BL21

M：標準蛋白質分子量；1：誘導的pET-32a-VP1/BL21；2：未誘導的pET- 32a-VP1/BL21；3：誘導的pET-32a/BL21；4：未誘導的pET-32a/BL21；5：誘導的pGEX-6P-1-VP1/BL21；6：未誘導的pGEX-6P-1-VP1/BL21；7：誘導的pGEX-6P-1/BL21；8：未誘導的pGEX-6P-1/BL21

M：Protein molecular weight marker；1：Induced pET-32a-VP1/BL21；2： Non-induced pET-32a-VP1/BL21； 3： Induced pET-32a/BL21； 4： Non-induced pET-32a/BL21； 5： Induced pGEX-6P-1-VP1/BL21； 6： Non-induced pGEX-6P-1-VP1/BL21； 7： Induced pGEX-6p-1/BL21； 8： Non- induced pGEX-6P-1/BL21

2. 2 VP1重組菌的融合表達及純化結果

對重組菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/ BL21的裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，再用考馬斯亮藍快速染色劑進行染色，結果觀察到重組菌的裂解產(chǎn)物分別在43.6和49.3 kD附近出現(xiàn)特異的蛋白條帶（圖4），與預期結果一致，而未經(jīng)誘導的菌液沒有呈現(xiàn)出對應的蛋白條帶。

2. 3 VP1融合蛋白的可溶性分析結果

誘導表達的重組菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX- 6p-1-VP1/BL21經(jīng)超聲波裂解后，分別取其上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體中（圖5）。

2. 4 VP1融合蛋白的純化結果

融合蛋白包涵體經(jīng)柱層析純化復性后，進行SDS-PAGE分析，結果發(fā)現(xiàn)獲得的目的蛋白條帶大小與預期結果一直，且條帶較清晰、單一（圖6），說明融合蛋白純化效果較好。

2. 5 VP1融合蛋白的Western blotting檢測分析結果

對純化復性的融合蛋白pET-32a-VP1和pGEX-6p- 1-VP1進行Western blotting檢測分析，發(fā)現(xiàn)在目的蛋白大小處出現(xiàn)特異性反應條帶（圖7），說明表達的VP1融合蛋白能與豚鼠抗A型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結合，但不與豚鼠抗O型和Asia1型FMDV陽性血清反應，即VP1融合蛋白具有相對特異的生物活性。

3 討論

完整的蛋白原核表達系統(tǒng)一般包括配套的表達菌株和表達載體，雖然原核表達存在蛋白翻譯后加工修飾不完善以致表達產(chǎn)物生物活性相對較低的缺點，但因其周期短、蛋白表達量大、成本低，表達菌株和表達載體選擇性多、背景清楚，且表達載體帶標簽有利于表達菌株的篩選和蛋白純化等優(yōu)點，已成為目前最成熟的體外蛋白表達系統(tǒng)（郭廣君等，2006）。pET和pGEX系統(tǒng)是常見的表達系統(tǒng)，其表達融合蛋白功能強大、基礎表達水平低、融合蛋白可根據(jù)相應的標簽蛋白進行層析純化（李瑋東等，1999）。因此，本研究選用pET-32a和pGEX-6p-1兩種表達載體來表達A型FMDV的VP1蛋白。

本研究結果表明，VP1融合蛋白的表達形式主要為包涵體，預試驗曾嘗試通過改變誘導條件包括溫度、轉速、誘導時間及IPTG濃度使其表達形式轉變?yōu)榭扇苄?，以簡化目的蛋白的純化，提高蛋白免疫原性，但發(fā)現(xiàn)VP1融合蛋白表達形式依然以包涵體為主，可溶性蛋白量很小，與王海烽等（2009）的研究結果一致。有關原核表達蛋白以包涵體形式表達的研究主要存在以下幾個觀點：（1）重組蛋白硫氨酸、脯氨酸含量較高；（2）蛋白表達速度快，肽鏈沒有足夠時間完成正常折疊；（3）表達蛋白濃度高，折疊中間體的溶解度有限；（4）表達系統(tǒng)缺少轉錄后的修飾和分子伴侶（Palmer and Wingfield，2012）。有報道稱，包涵體蛋白不需要結構和構象的修飾即可進行可逆性變性或復性（Tsumoto et al.，2003），并已證實包涵體通過化學解離能重折疊為有活性的蛋白（Seckler and Jaenicke，1992）。因此，VP1蛋白在原核表達系統(tǒng)中的高效表達，包涵體形式的存在不可避免，為獲得具有特異性和生物活性的重組蛋白，須進一步加強包涵體蛋白的純化與復性研究。

蛋白純化方式多樣，主要有鹽析、超濾、離子交換層析及親和層析等。?；菔|等（2009）利用His標簽蛋白親和層析法純化得到純度較高的C型FMDV VP1蛋白；宋英莉等（2012）利用離子交換層析法獲得純度較高的HtsA蛋白。本研究分別根據(jù)融合表達載體上的His和GST標簽蛋白進行親和層析純化，得到的融合蛋白純度較高，同時使用尿素對包涵體蛋白進行變性及透析復性，并在配制的復性緩沖液中加入促進二硫鍵形成的還原型/氧化型谷胱甘肽及促進天然構象形成和抑制聚集的L-精氨酸、甘油、Tris等試劑，蛋白復性取得良好效果。經(jīng)Western blotting檢測分析，發(fā)現(xiàn)VP1融合蛋白可與豚鼠抗A型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結合，但不與豚鼠抗O型和Asia1型FMDV陽性血清反應，說明目的蛋白具有良好的特異性和抗原性，加之純度較高，完全可用于易感動物的免疫及血清抗體篩查，為防控A型FMD奠定基礎。

4 結論

經(jīng)原核表達及純化獲得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特異性和抗原性，可用于易感動物的免疫及血清抗體篩查。

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（責任編輯 蘭宗寶）