熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)抗氧化物質(zhì)ORAC值的影響分析

許勝 黃慧明 屈達(dá)才 卓秋虹 趙紅平

摘 要 目的：實(shí)驗(yàn)定量探討熒光衰退時(shí)間間隔的選取對(duì)抗氧化物質(zhì)ORAC值的影響。方法：以維生素C和實(shí)驗(yàn)室自提的桑葚花色苷提取物為樣品，Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物，選取設(shè)置不同的熒光衰退時(shí)間間隔，應(yīng)用ORAC法測(cè)定樣品與標(biāo)準(zhǔn)物的熒光衰退曲線，計(jì)算樣品ORAC值，分析不同熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)樣品AUC、Net AUC和ORAC值的影響。結(jié)果：熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)于維生素C和桑葚花色苷提取物ORAC值的影響均在2%以內(nèi)，定量地表明了熒光衰退間隔時(shí)間對(duì)于論文中樣品ORAC值影響較小。結(jié)論：（1）研究結(jié)論為ORAC法中選取熒光衰退間隔時(shí)間提供參考，建議可在為1～5 min范圍內(nèi)隨機(jī)選取；（2）基于手動(dòng)記錄讀數(shù)的熒光酶標(biāo)儀，研究結(jié)論建議可選取較長(zhǎng)的熒光衰退間隔時(shí)間，如5 min，以有利于手動(dòng)記錄，也有利于與某些檢測(cè)時(shí)間較短的試樣交叉進(jìn)行。

關(guān)鍵詞 氧自由基清除能力；熒光衰退；間隔時(shí)間；維生素C；桑葚花色苷提取物

中圖分類(lèi)號(hào)：R-331；S888.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2016）09-00-05

氧自由基清除能力法（Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC）用于檢測(cè)樣品的總抗氧化能力，因其具有自動(dòng)化且標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，已然成為體外抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法之一，例如國(guó) 眾多生產(chǎn)商已經(jīng)將通過(guò)ORAC法測(cè)得的物質(zhì)ORAC值寫(xiě)在了商標(biāo)上以表明其產(chǎn)品的抗氧化能力。在ORAC法檢測(cè)中，基于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)不同時(shí)間間隔△t的抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox、被檢測(cè)樣品以及熒光素等的熒光衰退強(qiáng)度，并通過(guò)計(jì)算熒光衰退的凈面積計(jì)算被檢測(cè)樣品抗氧化能力的ORAC值。作為潛在的抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，諸多文獻(xiàn)對(duì)其ORAC檢測(cè)數(shù)值的影響因素做了深入探討，如鹽離子濃度，pH值與溫度等。

進(jìn)一步的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，不同的研究人員在檢測(cè)過(guò)程中選取的熒光衰退時(shí)間間隔△t是不一樣的，從1 min到5 min不等。例如Usami等測(cè)定甘藍(lán)ORAC值時(shí)△t選為1 min。張紅城[1]等測(cè)定蜂膠多酚ORAC值時(shí)△t選為1 min。湯杰[2]等測(cè)定桉葉提取物ORAC值時(shí)△t選為1.5 min。曹亞蘭[3]測(cè)定大豆肽ORAC值時(shí)△t選為2 min。Tai[4]等測(cè)定抗壞血酸原的ORAC值時(shí)采用的△t亦為2 min。何秋彤[5]等測(cè)定20種市售涼茶ORAC值時(shí)△t選為2.5 min，張水平[6]測(cè)定胡椒葉ORAC值時(shí)△t選為3 min，Wan[7]等測(cè)定大鼠血清ORAC值時(shí)△t選為4.5 min，林利美[8]等測(cè)定草魚(yú)肽ORAC值時(shí)△t選為4.5 min，李富華[9]等測(cè)定苦蕎麥皮黃酮ORAC值時(shí)△t選為4.5 min，Di[10]等測(cè)定牛酪蛋白水解物ORAC值與王立峰[11]等測(cè)定薏米酚類(lèi)提取物ORAC值時(shí)的△t選為5 min。盡管對(duì)于某一物質(zhì)，其熒光衰減曲線是一定的，但是選取不同的熒光衰退時(shí)間間隔決定了熒光強(qiáng)度衰退曲線的光滑度，也決定了ORAC值計(jì)算時(shí)所需的曲線下的面積，相當(dāng)于光滑曲線變?yōu)殡x散折線。一方面，熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)于ORAC值是否沒(méi)有影響，實(shí)驗(yàn)者是否可以任意選取，尚未有文獻(xiàn)定量討論；且在實(shí)際的檢測(cè)中，包括筆者在內(nèi)的不少研究人員都曾困惑如何選取合適的熒光衰退時(shí)間間隔；另一方面，有的熒光酶標(biāo)儀是手動(dòng)記錄讀數(shù)，如若熒光衰退間隔時(shí)間較短，會(huì)給人工記錄帶來(lái)不便，因此需要用較長(zhǎng)的熒光衰退間隔時(shí)間，且如若取較長(zhǎng)的熒光衰退間隔時(shí)間，還可在實(shí)際檢測(cè)中對(duì)于不同的樣品進(jìn)行交叉檢測(cè)，因有的樣品通過(guò)酶標(biāo)儀獲取OD值時(shí)僅需要很短時(shí)間。基于此，以維生素C（Vc）和實(shí)驗(yàn)室提取的桑葚花色苷提取物（Mulberry Fruit Anthocyanin Extraction，MFAE）為研究對(duì)象，在檢測(cè)中選取了不同的熒光衰退時(shí)間間隔，實(shí)驗(yàn)定量探討熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)于Vc和MFAE的ORAC值的影響，為ORAC法中選取熒光衰退間隔時(shí)間提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

維生素C（Vc）購(gòu)自西隴化工股份有限公司，桑椹花色苷提取物來(lái)自實(shí)驗(yàn)室提取。

1.1.2 主要儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀（EnVision，美國(guó)PerkinElmer）、移液槍?zhuān)ū本┐簖埮d創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。熒光素鈉（FL）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）均購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司，抗氧化物標(biāo)準(zhǔn)物Trolox購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司，磷酸氫二鉀與磷酸二氫鈉購(gòu)自北京化工廠；以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 ORAC實(shí)驗(yàn)方法

ORAC測(cè)定參照Tai[4]等的方法，并作一定修改。將測(cè)定溫度設(shè)置為37℃，在96孔熒光板各微孔加入20 μL不同濃度（1， 2， 4， 6， 8， 10 μmol/L）抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物Trolox溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；加入20 μL的1 mg/mL MFAE與20 μL的1 mg/mL Vc溶液（因本文討論間隔時(shí)間選取的影響，故固定樣液濃度）。隨后加入20 μL的75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），接著加入20 μL濃度為70 nmol/L熒光素（FL），待儀器測(cè)定溫度升至37℃后，將已加入體系溶液的96孔板放入儀器內(nèi)，孵育15 min。啟動(dòng)反應(yīng)前將熒光衰退測(cè)定間隔時(shí)間分別設(shè)為1， 2， 3， 4， 5 min，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，隨后用八道移液槍快速加入12 mmol/L AAPH 140 μL，立即啟動(dòng)測(cè)定；待各孔熒光衰退呈基線后停止測(cè)定。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品均設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值；ORAC值的計(jì)算方法參照Tai[4]。采用Origin 9.0軟件作圖分析。

2 結(jié)果分析

2.1 AAPH誘導(dǎo)不同濃度的Trolox與樣品熒光衰退曲線

加入AAPH后立即對(duì)體系溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，熒光強(qiáng)度衰退測(cè)定間隔時(shí)間分別設(shè)為1， 2， 3， 4， 5 min。圖1給出了熒光強(qiáng)度衰退測(cè)定間隔時(shí)間為1 min的熒光衰退曲線，熒光強(qiáng)度衰退測(cè)定間隔時(shí)間為2， 3， 4， 5 min的衰退曲線與圖1類(lèi)似。由圖1可知，熒光曲線衰退速率隨著抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox濃度的增大而減緩；未加抗氧化物質(zhì)的溶液體系，其熒光衰退曲線相對(duì)來(lái)說(shuō)較快，約125 min達(dá)到了基線狀態(tài)；202 min后，最高濃度Trolox（10 μmol/mL）熒光曲線到達(dá)基線狀態(tài)，說(shuō)明熒光素鈉被氧自由基破壞完全，測(cè)試反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)。熒光衰退曲線下的面積隨著Trolox濃度的增大而增大。相同濃度情況下，MFAE的熒光衰退明顯比Vc減緩，即Vc在125 min時(shí)基本呈基線趨勢(shì)，而MFAE熒光衰退達(dá)到基線狀態(tài)則需要180 min。由圖1可知，可直觀地看出MFAE抗氧化能力較Vc強(qiáng)。

2.2 熒光衰退間隔時(shí)間對(duì)于Trolox與樣品AUC數(shù)值的影響

由圖2可知，不同間隔時(shí)間對(duì)不同濃度Trolox、MFAE和Vc的AUC數(shù)值確系有一定的影響，即從△t為1 min至△t為3 min，所有曲線下的AUC數(shù)值均逐漸減?。浑S后，當(dāng)△t為4min時(shí)，所有曲線下的AUC數(shù)值增加；當(dāng)△t為5 min時(shí)，所有曲線下的AUC數(shù)值急劇下降至最低。進(jìn)一步地，從不同濃度Trolox、MFAE和Vc的AUC的數(shù)值上看，不同時(shí)間間隔下得到的AUC數(shù)值卻相差不大，即同一待測(cè)物AUC的最大數(shù)值與最小數(shù)值相差的百分比分別是：1.35%（1 μmol/L Trolox）、1.32%（2 μmol/L Trolox）、1.23%（4 μmol/L Trolox）、1.13%（6 μmol/L Trolox）、1.07%（8 μmol/L Trolox）、1.00%（10 μmol/L Trolox）、1.03%（MFAE）與1.40%（Vc）。

2.3 熒光衰退間隔時(shí)間對(duì)于Trolox與樣品Net AUC數(shù)值的影響

由圖3可知，不同間隔時(shí)間對(duì)不同濃度Trolox、MFAE和Vc的Net AUC（AUCTrolox– AUCblank）也有一定的影響。例如對(duì)于1 μmol/L的Trolox，隨著間隔時(shí)間的增加，Net AUC先減小后增加，且在間隔時(shí)間△t為3 min時(shí)達(dá)到最小值，而對(duì)于10 μmol/L的Trolox，隨著間隔時(shí)間的增加，Net AUC呈線性減??；對(duì)于MFAE，其N(xiāo)et AUC在△t為4 min時(shí)達(dá)到最小值，而對(duì)于Vc，其N(xiāo)et AUC在△t為5 min時(shí)達(dá)到最小值。從不同濃度Trolox、MFAE和Vc的Net AUC的數(shù)值上看，不同時(shí)間間隔下得到的Net AUC數(shù)值相差不大，即最大數(shù)值與最小數(shù)值相差的百分比分別是：1.31%（1 μmol/L Trolox）、0.64%（2 μmol/L Trolox）、0.21%（4 μmol/L Trolox）、0.34%（8 μmol/L Trolox）、0.31%（MFAE）與1.4%（Vc）。

2.4 熒光衰退間隔時(shí)間對(duì)于桑葚提取物與維生素C的ORAC數(shù)值的影響

由圖4可知，在本實(shí)驗(yàn)樣品的濃度下，桑葚花色苷提取物ORAC的數(shù)值較Vc的高，表明其抗氧化能力較強(qiáng)，約為Vc的5.8倍；隨著間隔時(shí)間的增加，對(duì)于桑葚提取物MFAE的ORAC值，除了在△t為4 min時(shí)下降，總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；進(jìn)一步地，在不同熒光衰退間隔時(shí)間下，MFAE的ORAC最大值為5527.5 μmol TE/g，最小值為5497.4 μmol TE/g，相差為30.1 μmol TE/g。對(duì)于維生素C的ORAC值，隨著間隔時(shí)間的增加首先增加，在△t為3 min時(shí)達(dá)到最大值；隨后逐漸減小，在△t為5 min時(shí)達(dá)到最小值；進(jìn)一步地，在不同熒光衰退間隔時(shí)間下，Vc的ORAC最大值為953.5 μmol TE/g，最小值為942.3 μmol TE/g，相差為11.2 μmol TE/g。從不同時(shí)間間隔下得到的ORAC數(shù)值的最大值與最小值的相差百分比上來(lái)看，MFAE的是0.55%，Vc的是1.2%，表明熒光衰退間隔時(shí)間的不同對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物Vc與自制樣品MFAE的ORAC計(jì)算值影響較小。

3 結(jié)語(yǔ)

本文以維生素C和桑葚花色苷提取物為研究對(duì)象，定量地探討了選取不同熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)于樣品ORAC值的影響。結(jié)果表明：在不同熒光衰退間隔時(shí)間下，從1 min到5 min，MFAE的ORAC最大值與最小值相差為30.1 μmol TE/g，相差百分比為0.55%；維生素C的ORAC最大值與最小值相差為11.2 μmol TE/g，相差百分比為1.2%；即熒光衰退時(shí)間間隔對(duì)于本文樣品ORAC值的影響均在2%以內(nèi)。因此，第一，本文的研究為ORAC法中選取熒光衰退間隔時(shí)間提供參考，建議可在為1～5 min范圍內(nèi)隨機(jī)選??；第二，基于手動(dòng)記錄讀數(shù)的熒光酶標(biāo)儀，建議選取較長(zhǎng)的熒光衰退間隔時(shí)間，如5 min，以有利于手動(dòng)記錄，也有利于與某些檢測(cè)時(shí)間較短的試樣交叉進(jìn)行。

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（責(zé)任編輯：趙中正）