H9亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體制備及鑒定

鄧顯文 謝芝勛 謝志勤 劉加波 龐耀珊 謝麗基 范晴 羅思思 黃莉 黃嬌玲 曾婷婷 張芳

摘要：【目的】制備H9亞型禽流感病毒（AIV）血凝素（HA）單克隆抗體，為檢測診斷AIV提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳詼缁頗9亞型AIV廣西分離株為免疫原，免疫6～8周BALB/c雌性小鼠，然后取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)血凝抑制試驗（HI）及間接免疫熒光試驗（IFA）篩選H9亞型AIV血凝素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞?！窘Y(jié)果】經(jīng)過4次亞克隆，獲得3株穩(wěn)定的H9單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為8A4、1B11和7F1細(xì)胞株，其細(xì)胞株培養(yǎng)上清液HI效價為27～210，腹水HI效價為216～219；單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果表明，3株H9單克隆抗體均屬于IgG1亞類，其輕鏈均為K鏈。3株H9單克隆抗體只與H9亞型AIV發(fā)生特異性HI反應(yīng)，而與其他HA亞型AIV及新城疫病毒（NDV）、減蛋綜合癥病毒（EDS）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）無交叉反應(yīng)。3株H9單克隆抗體細(xì)胞株的抗體分泌能力穩(wěn)定性良好?！窘Y(jié)論】用滅活H9亞型AIV為免疫原能成功制備針對H9亞型AIV血凝素的單克隆抗體，且具有良好的亞型廣譜性和特異性。

關(guān)鍵詞： 禽流感病毒（AIV）；H9亞型；血凝素；單克隆抗體；HI效價；亞型廣譜性

中圖分類號： S852.659.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0679-05

0 引言

【研究意義】禽流感（Avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染禽類引起的一類傳染?。ㄒ笳鸷蛣⒕叭A，1997），在我國廣泛存在，且近年來危害越來越嚴(yán)重，給我國造成至少600億元的經(jīng)濟(jì)損失（沙愛龍和劉澤隆，2007），其中2014年發(fā)生高致病性AI（H5N1亞型），累計發(fā)病家禽5.1萬羽，銷毀525.0萬羽（孫洪濤等，2015），甚至威脅到人類公共衛(wèi)生（王秀榮和陳化蘭，2005）。因此，加強AIV研究及建立快速準(zhǔn)確的診斷方法已成為AI防控工作的熱點和重點。【前人研究進(jìn)展】單克隆抗體因具有單一抗原決定簇的特異性，且效價高、理化性狀均一、重復(fù)性強、生產(chǎn)成本低，已被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)診斷（劉萍等，2012；祭芳等，2014）。李長瑜等（2007）用膠體金標(biāo)記提純的小鵝瘟病毒（Goose plaguo virus，GPV）單克隆抗體2B8并制備金標(biāo)棉，以馬抗GPV多克隆抗體和羊抗鼠抗體噴涂NC膜，組裝獲得只能檢測出GPV的膠體金檢測卡；張祥斌等（2008）制備獲得的豬流感病毒（SIV）單克隆抗體（F6A4C10）與H1N1亞型SIV抗原具有特異的免疫反應(yīng)性，為H1N1亞型SIV的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)；謝志勤等（2012）通過克隆篩選成功獲得2株能穩(wěn)定傳代并分泌抗禽呼腸孤病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（SF6-3K3和SB2-1K3），間接ELISA測定效價在105以上，具有良好的特異性，可用于禽呼腸孤病毒的特異性檢測；曹丙蕾等（2014）通過原核表達(dá)獲得了能與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）N蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體（6D10和3H5），能有效檢測到PRRSV經(jīng)典毒株和高致病性變異毒株。目前，國內(nèi)外己有制備AIV單克隆抗體并用于快速診斷的研究報道（孫林等，2010；楊霞等，2011；崔佳瑩等，2011），且效果顯著。此外，單克隆抗體在動物產(chǎn)品藥物殘留檢測技術(shù)方面也得到推廣應(yīng)用，并研制出獸藥殘留ELISA檢測試劑盒，其中一些已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益（李曉莉等，2009；李秀婷等，2009）?！颈狙芯壳腥朦c】AIV血凝素（Hemagglutinin，HA）直接參與AIV的致病過程，其編碼基因點的突變引起抗原變異，因此制備出針對不同亞型AIV的血凝素單克隆抗體，可為研發(fā)AIV檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，但至今鮮見有關(guān)H9亞型AIV血凝素單克隆抗體制備及鑒定的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以H9亞型AIV廣西分離株為抗原免疫BALB/c，采用雜交瘤技術(shù)制備特異的H9亞型AIV血凝素單克隆抗體，為檢測診斷AIV提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

AIV廣西分離株[A-chicken-Guangxi-LS-2013（H9N2）]、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、新城疫病毒（NDV）、減蛋綜合癥病毒（EDS）和傳染性支氣管炎病毒（IBV）由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室保存提供；6～8周SPF級BALB/c雌性小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；滅活劑β-丙內(nèi)醋、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、秋水仙素、HT培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、PEG（MW-4000）融合試劑和鼠源MAb亞類鑒定試劑盒均購自Sigma公司；胎牛血清購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hycon公司；96孔酶標(biāo)板、BSA及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、HRP和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自深圳晶美生物工程有限公司。

1. 2 單克隆抗體制備

1. 2. 1 動物免疫及單克隆抗體制備 用β-丙內(nèi)醋滅活已濃縮純化的AIV廣西分離株作為免疫抗原，首免用弗氏完全佐劑等體積乳化，多點皮下注射免疫6～8周BALB/c雌性小鼠；以弗氏不完全佐劑乳化病毒在首免后第21和35 d進(jìn)行加強免疫；最后一次免疫是在細(xì)胞融合前3 d尾靜脈采血測定抗體效價，選抗體效價高的小鼠經(jīng)腹腔注射加強免疫。無菌取免疫小鼠脾臟與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。

1. 2. 2 單克隆抗體檢測方法的建立 在細(xì)胞融合第9、12和15 d分別取融合細(xì)胞上清液，以4 U的AIV廣西分離株作檢測抗原，采用血凝抑制試驗（HI）檢測融合細(xì)胞上清液。同時以4 U的AIV廣西分離株作包被抗原，以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作陰性對照，免疫小鼠陽性血清作陽性對照，建立間接ELISA對融合細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測篩選。

1. 2. 3 腹水制備 用0.5 mL滅菌白油腹腔注射小鼠，7 d后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10 d后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時收集腹水。

1. 3 單克隆抗體鑒定

1. 3. 1 雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定 收集培養(yǎng)3～4 d的雜交瘤細(xì)胞，加入0.04～0.06 mg/mL秋水仙素，移入新瓶繼續(xù)培養(yǎng)6～10 h。收集細(xì)胞，用氯化鉀溶液進(jìn)行低滲處理，離心收集細(xì)胞后用新配制的甲醇—冰乙酸固定液固定，離心收集細(xì)胞，滴片后以姬姆薩染色，鏡檢觀察計數(shù)，并對雜交瘤細(xì)胞染色體組型進(jìn)行分析。

1. 3. 2 單克隆抗體亞類鑒定 取3株H9亞型AIV血凝素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞上清液，按照鼠源MAb亞類鑒定試劑盒說明對其進(jìn)行亞類鑒定。

1. 3. 3 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性檢測 在液氮中冷凍保存后第3和第6個月分別復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，收集上清液，用HI及間接ELISA檢測上清液中的H9單克隆抗體效價，測定H9單抗雜交瘤細(xì)胞的抗體分泌能力。

1. 3. 4 抗體效價測定 以HI測定培養(yǎng)上清液和腹水的H9單克隆抗體效價。

1. 3. 5 單克隆抗體廣譜性檢測 將H9單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別與H9亞型不同病毒分離株進(jìn)行HI試驗，檢測其廣譜性。

1. 3. 6 單克隆抗體特異性檢測 取H9單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別與不同亞型AIV毒株及NDV、EDS和IBV進(jìn)行HI試驗，檢測其特異性。

1. 3. 7 間接免疫熒光試驗（IFA） 按1∶100稀釋AIV廣西分離株，然后接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的MDCK細(xì)胞（史愛華等，2011）， 感染1.5 h后用PBS沖洗，加入胰酶于37 ℃培養(yǎng)48.0 h，用冰預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞，分別以8A4、1B11和7F1株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作一抗，以FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG作二抗，同時設(shè)陰性對照組，熒光顯微鏡下觀察攝影。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單克隆抗體制備及陽性細(xì)胞株建立

經(jīng)過細(xì)胞融合，采用HI檢測細(xì)胞上清液，結(jié)果篩選得到4株陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過4次亞克隆，同時用間接ELISA檢測，最后獲得3株穩(wěn)定的H9單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為8A4、1B11和7F1細(xì)胞株。

2. 2 單克隆抗體細(xì)胞株染色體鑒定結(jié)果

采用秋水仙素對3株穩(wěn)定的H9單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8A4、1B11和7F1細(xì)胞株的染色體數(shù)分別為106、109和104，說明3株雜交瘤細(xì)胞為骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的融合細(xì)胞（圖1）。

2. 3 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果

用鼠源單克隆抗體亞類鑒定試劑盒對8A4、1B11和7F1細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株H9單克隆抗體均屬于IgG1亞類，其輕鏈均為K鏈（表1）。

2. 4 血凝抑制效價結(jié)果

H9單克隆抗體8A4、1B11和7F1細(xì)胞株培養(yǎng)上清液的HI效價分別為29、210和27，腹水HI效價分別為217、219和216。說明用腹水制備的H9單克隆抗體HI效價非常高，符合單克隆抗體制備的要求。

2. 5 單克隆抗體廣譜性檢測結(jié)果

將8A4、1B11和7F1細(xì)胞株培養(yǎng)上清液分別與20株H9亞型AIV進(jìn)行HI試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株H9單克隆抗體能與18株H9亞型AIV產(chǎn)生良好反應(yīng)，僅有2株鳥類H9亞型AIV反應(yīng)較差（表2），說明3株H9單克隆抗體與H9亞型AIV均能結(jié)合，具有較好的廣譜性。

2. 6 單克隆抗體特異性檢測結(jié)果

以制備獲得的3株H9單克隆抗體與15株不同亞型AIV及NDV、EDS、IBV進(jìn)行HI試驗，結(jié)果表明， 3株H9單克隆抗體只與H9亞型AIV產(chǎn)生良好反應(yīng)，而與其他亞型AIV及NDV、EDS、IBV無交叉反應(yīng)，說明制備獲得的3株H9單克隆抗體具有良好的特異性（表3）。

2. 7 單克隆抗體穩(wěn)定性試驗結(jié)果

分別在液氮冷凍保存第3和第6個月復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，用HI檢測上清液中的H9單克隆抗體效價，結(jié)果顯示，其HI效價分別由29、210和27下降至28、29和26，說明3株H9單克隆抗體細(xì)胞株的抗體分泌能力穩(wěn)定性良好。

2. 8 間接免疫熒光試驗結(jié)果

由圖2可以看出，制備獲得的3株H9單克隆抗體均能與感染H9亞型AIV的MDCK細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，熒光顯微鏡下可觀察到明亮的綠色熒光，而未感染病毒的MDCK細(xì)胞未見綠色熒光。

3 討論

防控AI的關(guān)鍵技術(shù)是建立快速的AIV診斷方法。常規(guī)的病毒分離鑒定診斷周期長，HI試驗雖然普遍應(yīng)用，但多抗血清的制備繁瑣，且不同批次的質(zhì)量差異較明顯，其特異性和敏感性較差，批間檢測結(jié)果差異大（閆海濱等，2014）。目前，在各類疾病的病原檢測診斷中，單克隆抗體以其特異性高、敏感性強已被廣泛應(yīng)用。詹愛軍等（2008）、孫林等（2010）先后制備獲得H9亞型AIV血凝素單克隆抗體，能與H9亞型AIV發(fā)生特異的HI反應(yīng)，為AI快速診斷及AIV的抗原性分析等奠定了基礎(chǔ)。本研究以滅活的H9亞型AIV廣西分離株免疫BALB/c雌性小鼠，成功研制出3株H9亞型AIV血凝素蛋白的單克隆抗體，特異性檢測結(jié)果表明，制備獲得的3株H9單克隆抗體均保持了自然狀態(tài)下完整的抗原表位，具有很好的H9亞型特異性，與崔佳瑩等（2011）采用GD261分離株制備H5亞型AIV血凝素單克隆抗體的研究結(jié)果一致，只是亞型不同。

AIV亞型眾多，且在同亞型內(nèi)還包含有許多毒株，其抗原性存在較大差異。因此，制備的單克隆抗體必須進(jìn)行型特異性檢測和同型的排譜反應(yīng)。本研究對制備獲得的3株H9亞型單克隆抗體進(jìn)行廣譜性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均具有良好的HI反應(yīng)，只有2株從鳥類分離獲得的H9亞型AIV（5300035B-8和5300035B-15）反應(yīng)較差，說明從鳥類分離獲得的H9亞型AIV血凝素蛋白抗原發(fā)生了變異。這對AIV病原學(xué)診斷研究及防控H9亞型AI具有重要意義。

4 結(jié)論

用滅活H9亞型AIV為免疫原能成功制備針對H9亞型AIV血凝素的單克隆抗體，且具有良好的亞型廣譜性和特異性。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）