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    杠板歸總黃酮對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

    2016-05-30 06:26:40韋日明高雅張可鋒李迎迎
    關(guān)鍵詞:保護(hù)作用總黃酮小鼠

    韋日明 高雅 張可鋒 李迎迎

    摘要:【目的】探究杠板歸總黃酮的保肝藥作用及其作用機(jī)理,為杠板歸的深入研究提供活性物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)?!痉椒ā侩S機(jī)將60只小鼠分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性組(150 mg/kg)及杠板歸黃酮高劑量組(600 mg/kg)、中劑量組(400 mg/kg)、低劑量組(200 mg/kg),除正常組外,其余各組按16 mL/kg劑量灌胃56%vol白酒,1 h后各用藥組按20 mL/kg劑量灌胃給藥,正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水,連續(xù)給藥14 d,然后通過計(jì)算肝臟指數(shù)(LI)、脾臟指數(shù)(SI)、胸腺指數(shù)(TI),生化測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),ELISA檢測(cè)肝組織中白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等,探究杠板歸總黃酮對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。【結(jié)果】各杠板歸總黃酮?jiǎng)┝拷M可有效降低因酒精性肝損傷引起小鼠升高的LI,并升高SI和TI;又能降低血清ALT、AST活性及MDA含量,升高SOD活性;還可降低酒精性損傷肝組織中的IL-4、IL-6和TNF-α含量,且對(duì)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞壞死和變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等方面均有改善作用,尤其以杠板歸總黃酮高、中劑量組的效果最明顯。【結(jié)論】杠板歸總黃酮對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)理是通過抗脂質(zhì)過氧化、抑制肝臟炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)保肝作用。

    關(guān)鍵詞: 杠板歸;總黃酮;小鼠;酒精性肝損傷;保護(hù)作用

    中圖分類號(hào): S865.13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-1191(2016)04-0664-06

    0 引言

    【研究意義】藥材杠板歸為蓼科(Polygonaceae)植物杠板歸(Polygonum knotweed L.)的地上部分,又名貫葉蓼、蛇不過、老虎刺、犁尖草等,為多年生蔓性草本,在我國(guó)各地均有分布,資源非常豐富。杠板歸性微寒,味酸,有利水消腫、清熱解毒、止咳等功效,常用于治療腎炎水腫、百日咳、瀉痢、濕疹、癤腫、毒蛇咬傷等(江蘇新醫(yī)學(xué)院,2009),但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常被作為雜草丟棄,未能得到綜合利用。黃酮類化合物的生理功能多種多樣,如抗菌、抗氧化、抗自由基、抗癌、防癌、抗炎、抗病毒作用,目前在醫(yī)藥上已得到廣泛應(yīng)用(馮麗娟等,2014;劉品華等,2014;陳嬋等,2015)。因此,加強(qiáng)杠板歸總黃酮的藥理藥效研究,對(duì)其藥用開發(fā)及資源綜合利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前,已從杠板歸中提取獲得黃酮類化合物、植物甾醇、蒽醌類化合物、酚類、有機(jī)酸、烷烴類等化合物(王定勇和盧江紅,2004;張榮林等,2008;趙超等,2010),針對(duì)杠板歸有效成分提取工藝及其含量測(cè)定的研究也有較多報(bào)道(蔡小玲和張可鋒,2010;張明等,2012;陳建等,2013)。有關(guān)杠板歸黃酮類化合物的藥理藥效研究,溫云貴(2004)研究發(fā)現(xiàn)生杠板歸治療帶狀皰疹具有良好的療效;黃鶴飛等(2008)研究表明,杠板歸總提取部位有顯著的抗炎作用,其中乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等有抑菌作用;徐進(jìn)(2010)通過測(cè)定杠板歸中3個(gè)黃酮類化合物的抗氧化能力,結(jié)果表明3個(gè)黃酮類化合物均具有很好的抗氧化能力;邢煜君等(2011)通過考察杠板歸抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)杠板歸甲醇提取物的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性均最佳,推測(cè)其可用于糖尿病治療;高雅等(2014)研究發(fā)現(xiàn),杠板歸總黃酮對(duì)二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化(HF)具有良好的拮抗作用,其作用可能是通過抗肝損傷和降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】天然植物黃酮類化合物在抗腫瘤、心腦血管疾病具有顯著療效,且具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抑菌抗病毒、抗輻射、抗衰老和抗氧化等功效(曹緯國(guó)等,2003;劉品華等,2014)。檢索杠板歸總黃酮在保肝護(hù)肝方面的研究,僅高雅等(2014)報(bào)道杠板歸總黃酮對(duì)DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有良好的拮抗作用,未見其他相關(guān)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用小鼠酒精性肝損傷動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)P?,探究杠板歸總黃酮的保肝藥作用及其作用機(jī)理,以期為杠板歸的深入研究提供活性物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗(yàn)材料

    健康SPF級(jí)(許可證號(hào)SCXK2007-0001)小鼠60只,體重20~22 g,雌雄各半,由桂林醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。杠板歸總黃酮由桂林醫(yī)學(xué)院天然藥物教研室提供,純度為55.40%;56%vol白酒為京泰酒業(yè)有限公司生產(chǎn)的北京紅星二鍋頭;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;白介素-4(IL-4)、白介素-6(L-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自Elabscience公司。主要儀器設(shè)備:R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)、UV-2450/2550紫外—可見分光光度儀(日本島津公司)、Epoch酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)、UW-2200H電子天平(日本島津公司)、OLYMPUS BX51顯微鏡(奧林巴斯公司)、TGL-16K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)廠)。

    1. 2 試驗(yàn)方法

    隨機(jī)將60只小鼠分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性組(150 mg/kg)及杠板歸總黃酮高劑量組(600 mg/kg)、中劑量組(400 mg/kg)、低劑量組(200 mg/kg),每組10只。除正常組外,其余各組按16 mL/kg劑量灌胃56%vol白酒,每天1次,灌酒1 h后各用藥組按20 mL/kg劑量灌胃給藥,正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水,連續(xù)給藥14 d。于最后一次灌胃結(jié)束后禁食24 h,摘眼取血,收集肝臟、脾臟和胰腺。將血樣置于含有肝素的離心管中,3500 r/min離心8 min,分離血清,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?,或按檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定血清ALT、AST、SOD活性及MDA含量。通過稱重肝臟、脾臟和胸腺的重量,分別計(jì)算其指數(shù),其中肝臟指數(shù)(LI)=肝臟濕重(g)/體重(g)×1000;脾臟指數(shù)(SI)=脾臟濕重(g)/體重(g)×1000;胸腺指數(shù)(TI)=胸腺濕重(g)/體重(g)×1000。同時(shí)取各組小鼠肝左葉用10%甲醛固定,切片,HE染色,顯微鏡觀察肝組織病理改變;剩余肝臟用ELISA檢測(cè)肝組織中的IL-4、IL-6和TNF-α含量。

    1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-way-ANOVA)分析,并對(duì)樣本間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 杠板歸總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠LI、SI和TI的影響

    與正常組相比,模型組小鼠的LI極顯著升高(P<0.01,下同),而SI和TI極顯著降低,說明本研究構(gòu)建的動(dòng)物模型成功。與模型組比較,各用藥組均可降低小鼠LI,升高SI和TI,除杠板歸總黃酮低劑量組的差異顯著(P<0.05,下同)外,其他用藥組均達(dá)極顯著水平。此外,在本研究選擇的杠板歸黃酮?jiǎng)┝糠秶?00~600 mg/kg)內(nèi),呈良好的量效關(guān)系(圖1)。

    2. 2 杠板歸總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST、MDA和SOD的影響

    由圖2可以看出,與模型組比較,各杠板歸總黃酮?jiǎng)┝拷M均能有效降低因酒精性肝損傷引起小鼠血清ALT、AST升高的活性和MDA增加的含量,同時(shí)提高血清SOD活性,說明杠板歸總黃酮具有降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶和抗氧化的作用。

    2. 3 杠板歸總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、IL-4和IL-6的影響

    由圖3可以看出,與模型組比較,各杠板歸總黃酮?jiǎng)┝拷M均能有效抑制因酒精性肝損傷引起小鼠肝臟TNF-α、IL-4和IL-6含量的升高,說明杠板歸總黃酮具有顯著的抗炎作用,且呈良好的量效關(guān)系。

    2. 4 杠板歸總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

    肉眼觀察發(fā)現(xiàn),正常組小鼠的肝臟紅潤(rùn),表面細(xì)膩光滑,無淤血、黃染現(xiàn)象,切面紋理清晰;模型組小鼠的肝臟體積明顯變大,表面粗糙,紋理不清,表面可見淤血泛黃;與模型組比較,各用藥組小鼠的肝臟表面粗糙明顯改善,紋理較清晰,體積減小,淤血壞死減輕。肝臟組織切片(圖4)顯微觀察發(fā)現(xiàn):正常組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞無壞死和變性,匯管區(qū)呈放射狀排列,未見炎細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度明顯加重,點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死,炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象隨處可見;無論是施用聯(lián)苯雙酯還是施用杠板歸總黃酮,對(duì)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞壞死和變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等方面均有顯著的改善作用,尤其以杠板歸總黃酮高、中劑量組的效果最明顯。

    3 討論

    3. 1 杠板歸總黃酮對(duì)免疫系統(tǒng)的影響

    機(jī)體免疫功能與其肝臟、脾臟和胸腺免疫器官的重量改變密切相關(guān)。其中,肝臟內(nèi)含有強(qiáng)大吞噬功能的免疫細(xì)胞,具有防御免疫能力,故本研究選取LI為檢驗(yàn)指標(biāo)。脾臟、胸腺含有豐富的免疫細(xì)胞,胸腺為一級(jí)免疫器官,常介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),與T淋巴細(xì)胞的成熟有密切關(guān)系;脾臟為二級(jí)免疫器官,主要參與體液免疫,是抗體生成的場(chǎng)所(陳愛葵等,1999)。本研究結(jié)果表明,各杠板歸總黃酮?jiǎng)┝拷M均可降低因酒精性肝損傷后的小鼠LI,同時(shí)升高SI和TI,說明杠板歸總黃酮具有提高受損機(jī)體免疫能力的作用,與楊秀芬等(2007)研究發(fā)現(xiàn)燈盞乙素對(duì)小鼠免疫性肝損傷起保護(hù)作用的觀點(diǎn)一致。

    3. 2 杠板歸總黃酮對(duì)肝功能的影響

    ALT、AST常作為肝功能檢測(cè)的重要指標(biāo),ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中,AST存在于肝細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)。與正常組對(duì)比,模型組小鼠血清ALT、AST活性明顯增高,提示肝細(xì)胞膜被破壞和細(xì)胞膜通透性增加,肝細(xì)胞線粒體損傷嚴(yán)重(Zhang and Gao,2013)。本研究成功應(yīng)用酒精進(jìn)行建模,建模后的小鼠血清ALT、AST活性顯著升高,小鼠肝臟組織嚴(yán)重受損,但經(jīng)灌服杠板歸總黃酮后,酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性得到有效抑制,說明杠板歸總黃酮能夠降低受損肝臟轉(zhuǎn)氨酶的升高。

    3. 3 杠板歸總黃酮對(duì)抗氧化指標(biāo)的影響

    當(dāng)動(dòng)物肝損傷后會(huì)釋放出一些毒性介質(zhì),產(chǎn)生氧自由基而引起活性氧(ROS)增加,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,并形成MDA(楊波等,2012)。此外,肝損傷后其血清SOD活性降低,進(jìn)一步刺激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(高雅等,2014)。本研究結(jié)果顯示,杠板歸總黃酮能有效降低肝損傷血清中的MDA含量,升高SOD活性,說明杠板歸總黃酮具有清除脂質(zhì)過氧化物和提高抗氧化作用的功效。

    3. 4 杠板歸總黃酮對(duì)炎癥因子指標(biāo)的影響

    TNF-α具有多種生物活性,既可刺激細(xì)胞產(chǎn)生凋亡刺激因子,又能誘發(fā)中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附或活化中性粒細(xì)胞,促使其趨化聚集于肝臟釋放氧自由基或蛋白酶,激發(fā)炎癥反應(yīng)造成肝細(xì)胞毒性損傷(Gbele et al.,2009)。當(dāng)肝臟損傷后,通常伴隨著顯著的炎癥反應(yīng),其中炎癥因子IL-4可引起Th1細(xì)胞分泌IFN-γ和上調(diào)單核巨噬細(xì)胞表達(dá),誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì),如TNF-α等(Suetsugu et al.,2005)。IL-6作為一種炎性細(xì)胞因子,介導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng),同時(shí)通過對(duì)庫普弗細(xì)胞和肝細(xì)胞的不同作用途徑,誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡或抑制肝細(xì)胞再生(Schoenbom and Wilson,2007)。本研究結(jié)果提示,杠板歸總黃酮對(duì)酒精性肝組織中的TNF-α、IL-4和IL-6具有顯著抑制作用,尤其是高、中劑量組。可見,抑制肝臟損傷的炎癥因子是其保肝的作用機(jī)理之一。

    3. 5 杠板歸總黃酮對(duì)肝組織結(jié)構(gòu)變化的影響

    大量研究發(fā)現(xiàn),中藥對(duì)肝臟組織損傷具有良好的保護(hù)效果,可改善受損肝臟組織的結(jié)構(gòu)。馬駿等(2008)研究發(fā)現(xiàn),肝纖膠囊對(duì)CCl4造成的受損肝臟組織結(jié)構(gòu)有顯著的改善作用,可保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及減輕炎癥。李明和張可鋒(2010)研究發(fā)現(xiàn),穿破石總黃酮明顯改善肝細(xì)胞的壞死程度,改善后的肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞索狀排列較整齊,肝內(nèi)淤血及細(xì)胞腫脹明顯減輕,點(diǎn)灶狀壞死明顯減少。本研究通過肉眼和組織病理學(xué)觀察杠板歸總黃酮對(duì)受損肝臟表面和組織結(jié)構(gòu)的改善情況,結(jié)果表明,酒精性肝損傷小鼠的肝臟體積明顯變大,表面粗糙,紋理不清,可見淤血泛黃;肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度明顯加重,點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死,炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯;而經(jīng)杠板歸總黃酮干預(yù)后,受損的肝臟外表整體結(jié)構(gòu)和內(nèi)部組織壞死、淤血和炎癥方面明顯改善,證實(shí)杠板歸總黃酮具有修復(fù)肝損傷結(jié)構(gòu)的作用。

    4 結(jié)論

    杠板歸總黃酮對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)理是通過抗脂質(zhì)過氧化、抑制肝臟炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)保肝作用。

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    (責(zé)任編輯 蘭宗寶)

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