一種烯啶蟲(chóng)胺新型半抗原的合成與免疫應(yīng)用

趙方方　羅金輝　謝德芳　呂岱竹

摘 要 為建立烯啶蟲(chóng)胺（nitenpyram，NIT）殘留免疫分析方法，通過(guò)合成烯啶蟲(chóng)胺新型半抗原并進(jìn)行紫外和質(zhì)譜等技術(shù)的分析確證，分別將半抗原與牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)成完全的免疫抗原和包被抗原。免疫小鼠后測(cè)定抗血清的效價(jià)，隨著免疫次數(shù)的增加先逐漸升高后再逐漸降低，最高達(dá)到1 ∶ 16 000。選取抗血清效價(jià)最高的小鼠，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定其靈敏度，其半抑制濃度（IC50）較低，為1.68 μg/mL，競(jìng)爭(zhēng)效果明顯。將建立的檢測(cè)方法與液相色譜方法進(jìn)行比較，雖線性范圍和靈敏度較液相色譜方法稍低，但回收率均≥80%，無(wú)明顯差異，具有明顯的識(shí)別效應(yīng)，為烯啶蟲(chóng)胺高靈敏的單克隆抗體制備及殘留免疫分析奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 烯啶蟲(chóng)胺；新型半抗原；合成；免疫效果

中圖分類號(hào) TQ450.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A new type of nitenpyram hapten was analyzed and confirmed after being synthesized by UV spectrum and mass spetrum in order to establish a method for the analysis of the residues of nitenpyram（NIT）. And the NIT hapten was then coupled with BSA and OVA to prepare immunogen （NIT-BSA） and coating antigen （NIT-OVA）. The titer of the antiserum was determined by immune mice， and the titer increased and then reduced gradually with the increase of the number of times. The maximum reached 1 ∶ 16 000. The mice with the highest titer were selected， and the sensitivity was determined by indirect competitive ELISA method. The IC50 was 1.68 μg/mL， the semi inhibition concentration was low and the competition effect was obvious. Compared with the method of liquid chromatography， the linearity range and sensitivity are slightly lower than that of liquid chromatography. The two recovery rates were more than 80% without obvious difference which showed obvious recognition effect. This study laid a foundation for the preparation of monoclonal antibodies that has the high sensitivity and the immunoassay.

Key words Nitenpyram；New type of hapten；Synthesis；Immune effect

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.024

烯啶蟲(chóng)胺是日本繼吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒之后開(kāi)發(fā)的又一種新煙堿類農(nóng)藥，具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性和滲透性，對(duì)于飛虱、蚜蟲(chóng)、粉虱等刺吸式口器害蟲(chóng)具有較強(qiáng)的滅殺效果，廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、水稻等作物害蟲(chóng)的防治，現(xiàn)已成為有機(jī)磷、有機(jī)氯等高毒農(nóng)藥及產(chǎn)生抗性的擬除蟲(chóng)菊 酯類等農(nóng)藥的優(yōu)秀替代品種[1-4]。然而該藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛、大量的使用，同時(shí)因其強(qiáng)大的內(nèi)吸和滲透作用，很容易造成果蔬等生鮮食用的作物中殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的身體健康[5-6]。因此，加強(qiáng)對(duì)上市果蔬中烯啶蟲(chóng)胺殘留檢測(cè)十分必要。

文獻(xiàn)報(bào)道的烯啶蟲(chóng)胺檢測(cè)方法主要有液相色譜[7-9]、氣相色譜[10]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[11-12]。而針對(duì)果蔬等貨架期較短的產(chǎn)品，這些方法普遍存在時(shí)間久、費(fèi)用高、操作復(fù)雜等不適用性，因此，建立快速、靈敏、廉價(jià)的免疫檢測(cè)方法對(duì)于此類產(chǎn)品具有重要意義[13-15]。彭方毅等[15]建立了定量測(cè)定吡蟲(chóng)啉的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法；李廣領(lǐng)等[13]建立了噻蟲(chóng)嗪殘留酶聯(lián)免疫吸附的檢測(cè)方法，線性范圍良好，檢出限達(dá)到0.001 mg/L。而目前針對(duì)烯啶蟲(chóng)胺建立的殘留免疫分析方法只有王俊平等[16]在烯啶蟲(chóng)胺分子芳環(huán)上添加連接臂連接載體蛋白進(jìn)行免疫。本研究將煙堿類農(nóng)藥的特征性芳環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行暴露，對(duì)烯啶蟲(chóng)胺分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾，從遠(yuǎn)芳環(huán)端進(jìn)行修飾，再與大分子載體共價(jià)偶聯(lián)制備其完全抗原，通過(guò)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)烯啶蟲(chóng)胺的特異性抗體，為烯啶蟲(chóng)胺殘留免疫分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 烯啶蟲(chóng)胺（98%）購(gòu)自武漢康泰寶精細(xì)化工公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCl），弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)自sigma公司；其他試劑購(gòu)自國(guó)藥公司，水為實(shí)驗(yàn)室制備超純水

1.1.2 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（ELx800，Biotek公司）、超純水系統(tǒng)（ULUP-IV-20T，成都超純科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-3，Buchi公司）、洗板機(jī)（Elx50，Biotek公司）、電泳儀（PowerPac，bio-rad公司）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（API4000，AB SCIEX公司）

1.2 方法

1.2.1 半抗原的合成 稱取5.26 g（19 mmol）烯啶蟲(chóng)胺（98%）置于三口瓶中，加適量無(wú)水乙醇溶解后，在70 ℃恒溫通入氮?dú)?，加入二水合氯化亞錫21.44 g，加入無(wú)水乙醇使氯化亞錫完全溶解，通氮?dú)?5 min后密封，持續(xù)通入冷凝水，磁力攪拌反應(yīng)2 h后揮干乙醇，加入碳酸鈉溶液（6.00 g碳酸鈉溶于40 mL水），使混合液pH=8-9，劇烈振搖后靜置過(guò)濾，用乙酸乙酯萃取上清3次，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜后蒸干，用硅膠柱凈化后得到4.08 g淺黃色膠狀物質(zhì)，產(chǎn)率為89.2%，Rf=0.329（乙酸乙酯∶石油醚=1 ∶ 3），反應(yīng)線路見(jiàn)圖1。

1.2.2 完全人工抗原的合成 稱取400 mg BSA（合成免疫原）或OVA（合成包被原），溶于3 mL pH=5的PBS溶液中，加入2 g EDC，攪拌使其完全溶解活化20 min，然后加入0.20 g NHS攪拌反應(yīng)30 min。稱取200 mg半抗原溶于少量DMF中，并滴入上述蛋白活化液中，邊滴邊攪拌，反應(yīng)過(guò)夜。將反應(yīng)液裝入透析袋中于4度下透析，透析液為PBS緩沖液，每6～10 h換一次透析液，透析72 h后將反應(yīng)液定容，反應(yīng)線路見(jiàn)圖2。

1.2.3 抗原濃度的測(cè)定 根據(jù)蛋白溶液光密度值測(cè)定抗原濃度[17]，測(cè)定波長(zhǎng)為280 nm和260 nm抗原溶液的OD值，按照公式：蛋白濃度（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260，計(jì)算抗原濃度。

1.2.4 免疫試驗(yàn) 將免疫原對(duì)小鼠按照表1所示流程進(jìn)行免疫。

1.2.5 抗血清多克隆抗體的應(yīng)用 包被不同濃度梯度抗原，使用上述小鼠的抗血清進(jìn)行梯度稀釋，使用十字交叉法進(jìn)行抗原和抗體濃度的優(yōu)化，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。確定烯啶蟲(chóng)胺最大吸收波長(zhǎng)，優(yōu)化流動(dòng)相組成及配比，建立烯啶蟲(chóng)胺液相色譜檢測(cè)方法。液相色譜采用紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)為272 nm，甲醇 ∶ 水=15 ∶ 85為流動(dòng)相，進(jìn)行檢測(cè)。分別建立2種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，前處理按照標(biāo)準(zhǔn)[18]進(jìn)行；同時(shí)進(jìn)行2種方法的樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)（濃度為0.10 μg/g），并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成鑒定

半抗原合成反應(yīng)進(jìn)行時(shí)用TLC監(jiān)測(cè)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，在紫外燈下觀察唯一吸收點(diǎn)（Rf=0.32），比原料點(diǎn)（Rf=0.75）小，說(shuō)明極性比烯啶蟲(chóng)胺大，與理論分析結(jié)果一致。

對(duì)半抗原進(jìn)行核磁共振（氫譜）分析，1H-NMR（600 M，CDCl3，TMS），δ：4.63（s，1H，CHN）；1.88～2.12（t，1H，NH）；2.35～2.53（d，3H，CH3）；2.33～2.63（m，2H，CH2CH3）；0.88～1.12（t，3H，CH2CH3）；3.83（s，1H，CHN）；7.75～9.06（m，3H，CH）；所得數(shù)據(jù)與氫原子位移的理論分析結(jié)果一致。

質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)圖3，其中準(zhǔn)分子離子峰（[M-H]-=239.26）豐度最大，與目標(biāo)產(chǎn)物的分子量一致，且存在Cl元素的同位素峰；從分子結(jié)構(gòu)分析，在電離時(shí)能量較低的2個(gè)雙鍵C原子與N原子成鍵能量較低且容易斷裂，脫掉-NH-CH3、-NH2成鍵斷裂后形成新的離子，理論分子量為195，與質(zhì)譜圖中195.24峰吻合，說(shuō)明半抗原合成成功。

2.2 抗原的鑒定

將透析后的人工抗原離心后除去變性及自身結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，采用電泳進(jìn)行完全抗原的鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4，與半抗原反應(yīng)以后的載體蛋白質(zhì)（BSA、OVA）均比載體蛋白在電場(chǎng)中的位移要小，說(shuō)明載體蛋白結(jié)合了其他物質(zhì)，導(dǎo)致分子量增大，而且根據(jù)電場(chǎng)力公式及加速度公式有S=F/2m×t2，說(shuō)明在電泳時(shí)間相同的情況下，位移跟質(zhì)量成正比，說(shuō)明不是蛋白質(zhì)之間的結(jié)合而是蛋白質(zhì)結(jié)合了小分子量的半抗原。

2.3 抗原濃度

抗原溶液的OD值見(jiàn)表2，經(jīng)過(guò)計(jì)算，得出免疫原的濃度為0.163 mg/mL，包被原的濃度為0.168 mg/mL。

2.4 抗血清效價(jià)

從第2次開(kāi)始，每次免疫后1周對(duì)小鼠斷尾取血，間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖5，隨著免疫次數(shù)的增加，效價(jià)逐漸增加至最大值，然后開(kāi)始出現(xiàn)下降，1號(hào)小鼠效價(jià)最高達(dá)1 ∶ 16 000。

2.5 免疫效果

選取抗血清效價(jià)較高的1號(hào)小鼠，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定其抗血清中多克隆抗體的靈敏度，其IC50為1.68 μg/mL（圖6），免疫效果明顯，直接證明了半抗原及完全抗原的合成成功。

2.6 抗血清的應(yīng)用

選擇十字交叉法中OD值為1所對(duì)應(yīng)的抗原和抗體濃度建立間接ELISA法，其中包被抗原濃度為0.2 μg/g，抗血清進(jìn)行1 ∶ 8 000倍稀釋，將結(jié)果與所建立的液相方法進(jìn)行比較，其標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表3。2種方法回收率均位于80%～90%，均為較佳結(jié)果且無(wú)明顯差異，但ELISA方法的線性范圍較窄為0.72～3.30 μg/mL，對(duì)比之下液相色譜法線性范圍較寬，為0.025～5.00 μg/mL。因此，所建立的ELISA方法適宜測(cè)量的樣品濃度范圍小。此外，ELISA檢測(cè)限也較液相色譜法高，說(shuō)明多克隆抗體直接應(yīng)用于樣品的檢測(cè)還存在一定的局限性。但本研究為高質(zhì)量的單克隆抗體的研制提供了較好的預(yù)期。

3 討論與結(jié)論

目前，普遍的烯啶蟲(chóng)胺殘留檢測(cè)主要采用色譜、色譜質(zhì)譜聯(lián)用等儀器檢測(cè)法。然而這些方法普遍存在著分析時(shí)間久、費(fèi)用高、操作專業(yè)等缺點(diǎn)。相對(duì)于這些缺點(diǎn)，免疫檢測(cè)具有速度快、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)烯啶蟲(chóng)胺這種水溶性大的農(nóng)藥尤其適用。

王俊平等[16]報(bào)道的烯啶蟲(chóng)胺的半抗原是從新煙堿農(nóng)藥的特征結(jié)構(gòu)-芳香環(huán)處進(jìn)行修飾，添加連接臂，與其不同的是本研究針對(duì)此特征性芳環(huán)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了新型的半抗原，并通過(guò)對(duì)烯啶蟲(chóng)胺分子進(jìn)行改造，在遠(yuǎn)離芳環(huán)端改造基團(tuán)，成功合成了能夠暴露其特征結(jié)構(gòu)的烯啶蟲(chóng)胺半抗原，與從頭合成相比，最大程度的保留了烯啶蟲(chóng)胺的原有特征，以確保動(dòng)物機(jī)體對(duì)烯啶蟲(chóng)胺或新煙堿類農(nóng)藥的識(shí)別程度，以獲得靈敏度較高的多克隆抗血清。

與彭方毅等[15]、王俊平等[16]、李廣領(lǐng)等[19]所做的新煙堿類農(nóng)藥單克隆抗體進(jìn)行比較，本研究所制備的多克隆抗血清的靈敏度與其還存在一定差距，這是由于初步免疫時(shí)，抗原組分復(fù)雜，產(chǎn)生的多克隆抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)較多，導(dǎo)致非特異性較強(qiáng)，靈敏度較差，是多克隆抗體的特性所決定的。通常此類研究都是從靈敏度和特異性相對(duì)較強(qiáng)的多克隆抗體入手，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選、馴化，以得到靈敏度和特異性較高的單克隆抗體。與液相色譜法相比，通過(guò)該多克隆抗體建立的檢測(cè)方法回收率較好，無(wú)明顯差異，但線性范圍比液相色譜法小，檢測(cè)靈敏度較低，說(shuō)明多克隆抗體直接應(yīng)用于樣品的檢測(cè)還存在一定的局限性，但其為高質(zhì)量的單克隆抗體的研制提供了較好的預(yù)期。

本研究初步驗(yàn)證了該新型抗原具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，為烯啶蟲(chóng)胺高靈敏度或高通用性新煙堿類單克隆抗體的研制做了前期研究，也奠定了較為良好的基礎(chǔ)，以期能夠研制出高靈敏度或高通用性的單克隆抗體。

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