番茄不孕病毒（TAV）脫除對懷白菊葉綠素含量及氮代謝相關(guān)指標的影響

趙喜亭 朱玉婷 田瑩 王昭陽 周穎媛 范子建 蔣麗微 李明軍

摘要：【目的】探究番茄不孕病毒（TAV）脫除對懷白菊葉綠素含量和氮代謝水平的影響，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳郧捌讷@得的TAV脫除懷白菊試管苗為試材，以未經(jīng)脫除TAV的試管苗為對照（CK），對兩者進行繼代培養(yǎng)，并測定培養(yǎng)過程中葉片葉綠素含量及氮代謝的相關(guān)生理指標?！窘Y(jié)果】繼代培養(yǎng)過程中，CK與TAV脫除懷白菊試管苗葉片的葉綠素α和葉綠素b含量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高，兩者均以繼代第22 d時的增幅最大，分別為5.24%和41.69%。與CK相比，TAV脫除提高了相同培養(yǎng)天數(shù)時葉片的葉綠素a、葉綠素b含量，且差異達顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01）水平。懷白菊脫除TAV病毒后，其硝酸還原酶（NR）活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量在繼代培養(yǎng)過程中均顯著高于CK，三者最大增幅分別為27.99%（繼代22 d）、28.10%（繼代22 d）和5.89%（繼代38 d）。【結(jié)論】TAV脫除能有效提高懷白菊的葉綠素含量及氮代謝水平，利于其生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞： 懷白菊；番茄不孕病毒；脫毒；葉綠素含量；氮代謝

中圖分類號： S567.239 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1095-05

0 引言

【研究意義】懷白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai）為菊科（Asteraceae）菊屬（Chrysanthemum L.）植物，特指產(chǎn)于古懷慶府（今河南省溫縣一帶）的藥菊，因其具有較高的藥用價值而備受青睞。懷白菊主要靠扦插、分株等營養(yǎng)方式進行繁殖，長期的營養(yǎng)繁殖使病毒危害嚴重，引起植株不同程度地花葉、壞死、萎縮等，嚴重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。經(jīng)過本課題組前期對河南省焦作市一帶染病懷白菊進行鑒定后發(fā)現(xiàn)，其主要感染病毒為番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV），并探明了TAV的結(jié)構(gòu)和全核苷酸序列（Zhao et al.，2015）。TAV是一種RNA病毒，以非持久性的方式由多種蚜蟲傳播或汁液接種傳播，在懷白菊上普遍發(fā)生。因此，開展懷白菊TAV病毒脫除及脫除后對其生理生化影響的研究，可為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】針對病毒危害問題，各種植物脫毒技術(shù)應(yīng)運而生并取得了較好的效果（Wang and Valkonen，2009；欒愛萍，2012；Budiarto，2013）。因懷白菊作為道地藥材的特殊性，為保持藥材的綠色環(huán)保，莖尖結(jié)合熱處理可作為其脫除病毒的首選方法。本研究室前期已通過莖尖結(jié)合熱處理脫除了懷白菊的TAV病毒。大量研究表明，植物脫除病毒后，其生理生化特性均會有一定程度的提高，如安徽藥菊（薛建平等，2004）、香石竹（王麗花等，2012）脫毒后其葉綠素含量提高，光合速率在一定程度上也隨之提高。氮代謝是植物體內(nèi)一個重要的生理過程，直接影響著植物的產(chǎn)量和品質(zhì)（張智猛等，2006），甘薯、蘋果脫除病毒后，光合能力提高，氮代謝活躍，葉片游離脯氨酸、可溶性蛋白含量增加，硝酸還原酶（NR）活性明顯增強（陳選陽等，2001；吳玉霞，2008；周全盧等，2014）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組結(jié)合懷白菊生產(chǎn)實際從2011年開始致力于病毒調(diào)查、鑒定、脫除及病毒脫除后的活性氧代謝與生理生化變化、脫毒苗的大田適應(yīng)性等方面的研究，明確了TAV是其感染的主要病毒（Zhao et al.，2015），TAV脫除降低了其活性氧代謝水平，增強了其抗氧化能力（趙喜亭等，2015）。但TAV脫除對懷白菊葉片光合作用和氮代謝水平的影響尚不清楚，需進一步探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以前期獲得的TAV脫除懷白菊試管苗為試材，通過對其光合和氮代謝相關(guān)指標進行測定，研究繼代培養(yǎng)過程中TAV脫除后懷白菊葉片葉綠素a和葉綠素b含量、NR活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量的變化，旨在探索TAV脫除對懷白菊光合和氮代謝水平的影響，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料原始植株具有感染病毒的特征，采集于河南科霖達菊珍飲品股份有限公司的懷菊花種植基地，由河南省溫縣農(nóng)業(yè)科學研究所王天亮高級農(nóng)藝師進行基原鑒定為懷白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai），之后在綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實驗室（河南師范大學生命科學學院）建立無菌試管苗，采用莖尖結(jié)合熱處理的方法獲得莖尖苗，經(jīng)RT-PCR檢測得到脫除TAV的懷白菊試管苗（繼代22 d）。

1. 2 試驗方法

試驗在河南師范大學綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實驗室進行。將前期獲得的脫除TAV的懷白菊試管苗（Virus-free）及其對照苗（未經(jīng)脫除TAV的試管苗，CK）在超凈工作臺上切成帶有腋芽的莖段（長約1 cm），接種于1/2 MS+NAA 0.01 mg/L生根培養(yǎng)基中，放入溫度為25 ℃、光強3000 lx、光照12 h的培養(yǎng)室中進行繼代培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第22 d，挑選長勢基本一致的組培苗，取頂端完全展開第二、三片葉片測定其葉綠素含量及氮代謝相關(guān)指標，每隔8 d測定1次，即第22、30、38、46和54 d進行測定，每個指標測定3個樣本，共測定5次。

1. 3 測定項目及方法

葉綠素a和葉綠素b含量采用丙酮乙醇混合液比色法測定（李合生，2000），以丙酮乙醇混合液（體積比為1∶1）為提取液，按葉片∶丙酮（g∶mL）=1∶150比例在黑暗下提取24 h，于645和663 nm下進行比色，按下列公式計算葉綠素含量：

式中，Ca、Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度，A663和A645分別為葉綠素溶液在663和645 nm處的吸光值。

葉綠素含量（mg/g）=葉綠素濃度×提取液總體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重

NR活力采用離體磺胺比色法測定（李合生，2000）；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定（李合生，2000）；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭染色法測定（趙喜亭等，2011）。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 13.0進行整理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 TAV脫除對懷白菊試管苗葉綠素含量的影響

如圖1所示，在繼代培養(yǎng)過程中，懷白菊試管苗葉片中葉綠素a和葉綠素b含量變化趨勢相同，均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高，且TAV脫除未改變?nèi)~片葉綠素含量的變化趨勢。與CK相比，相同培養(yǎng)時間點下TAV脫除試管苗葉片的葉綠素a和葉綠素b含量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）升高，兩者均以繼代培養(yǎng)第22 d時的增幅最大，分別為5.24%和41.69%，與CK差異極顯著。

2. 2 TAV脫除對懷白菊試管苗氮代謝相關(guān)指標的影響

2. 2. 1 NR活力 由圖2可看出，繼代培養(yǎng)過程中，CK與TAV脫除試管苗葉片NR活力均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈先升高后降低的變化趨勢，培養(yǎng)至第46 d時達最大值。TAV脫除試管苗葉片NR活力除在第46 d時顯著高于CK外，其他對應(yīng)培養(yǎng)時間點的NR活力均極顯著高于CK，其中在繼代22 d時的增幅最大，為27.99%。

2. 2. 2 游離脯氨酸含量 由圖3可看出，繼代培養(yǎng)過程中， CK與TAV脫除試管苗葉片的游離脯氨酸含量均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高。與CK相比，TAV脫除提高了相同培養(yǎng)天數(shù)時葉片的游離脯氨酸含量， 繼代培養(yǎng)22、46和54 d時游離脯氨酸含量顯著提高，最大增幅為28.10%（繼代22 d）。

2. 2. 3 可溶性蛋白含量 由圖4可看出，繼代培養(yǎng)過程中，CK與TAV脫除試管苗葉片的可溶性蛋白含量均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高。與CK相比，TAV脫除顯著提高了與相同培養(yǎng)天數(shù)時葉片的可溶性蛋白含量，最大增幅為5.89%（繼代38 d）。

3 討論

葉綠素是與光合作用相關(guān)的重要色素分子，參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，在光合作用中扮演重要的角色，其含量的高低在一定程度上可反映植物的光合能力（張國民等，2000）。葉綠素a是光合作用的中心色素分子，葉綠素b是聚光色素。植物感染病毒后，其葉綠體數(shù)量及結(jié)構(gòu)會遭到不同程度破壞，導致葉綠素含量降低，進而影響植物光合作用。植物脫除病毒能夠降低病毒對其葉綠體數(shù)量及結(jié)構(gòu)的傷害，使葉綠素含量有不同程度的提高，如薛建平等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，安徽藥菊脫除病毒后葉綠素含量及凈光合速率均有所提高；葛曉霞等（2006）研究表明，脫毒駿棗樹葉片葉綠素含量均高于對照，光合速率總體明顯高于普通駿棗樹，尤其在上午8：00～12：00時平均增高10.7%～

76.6%；王麗花等（2012）研究表明，香石竹經(jīng)過脫毒處理后其葉綠素a和葉綠素b含量均顯著高于非脫毒苗。本研究結(jié)果表明，與未進行脫毒的試管苗相比，TAV脫除提高了懷白菊繼代培養(yǎng)過程中相同培養(yǎng)天數(shù)時葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，且差異達顯著水平，其中葉綠素b含量最大增幅達41.69%（繼代22 d）。表明TAV脫除能夠使懷白菊維持較高的葉綠素水平，在相同光照條件下，能夠吸收更多光能，有利于提高懷白菊光合能力。

氮代謝是植物體內(nèi)一個重要的生理過程，包括無機氮的還原、同化及有機含氮化合物轉(zhuǎn)化、合成等過程（Miller and Cramer，2004）。與其相關(guān)的生理指標主要有NR活性、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量等，這些指標對植物生長均具有重要作用（陳永明等，2014；孫菲菲等，2014；唐秀梅等，2014）。NR可催化植物體內(nèi)硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是植物氮同化過程中關(guān)鍵的限速酶，葉片中NR活性的高低控制著整個同化過程，其強弱在一定程度上反映了光合、呼吸及蛋白質(zhì)合成和氮代謝活性（張智猛等，2006；林麗琳等，2015）。脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，并以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中，是逆境下植物體內(nèi)氮和能量的貯存庫，對植物體內(nèi)的酶和膜結(jié)構(gòu)有保護作用（陸彬彬，2004）。大多數(shù)可溶性蛋白是參加各種代謝的酶類，其含量是植物總體代謝的一個重要指標（宋新穎等，2014）。研究表明，植物脫除病毒能夠降低病毒對其自身生理活動的影響，從而提高植物吸收和利用氮的能力，減少硝酸鹽的積累，促進氨基酸的合成，進而利于植株的生長，如陳選陽等（2001）研究表明，甘薯脫除病毒后其氮代謝活躍，葉片游離脯氨酸含量增加，硝酸還原酶活性明顯增強；吳玉霞（2008）研究發(fā)現(xiàn)，在試管苗生長后期，華紅、粉紅佳人和煙富一號3個蘋果品種脫毒苗葉片中的脯氨酸含量、硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量均顯著高于普通苗，且差異達極顯著水平。本研究結(jié)果與上述前人研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，懷白菊脫除TAV病毒后，其NR活力、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量在繼代培養(yǎng)過程中均顯著高于非脫毒苗，三者增加最大幅度值分別為27.99%（繼代22 d）、28.10%（繼代22 d）和5.89%（繼代38 d）。脫除TAV的懷白菊硝酸還原酶活性提高，能夠減少硝酸鹽在葉片內(nèi)的積累，降低可溶性氮化合物的積聚，從而促進部分氨基酸與蛋白質(zhì)的合成。說明TAV脫除使懷白菊在繼代培養(yǎng)過程中維持著較高水平的氮代謝。

植物氮代謝與葉綠素含量及光合能力密切相關(guān)。光合作用是作物生長最基本的生理過程之一，其生成的同化力和代謝中間產(chǎn)物被氮代謝所利用。氮是葉綠素、蛋白質(zhì)和酶的重要組成物質(zhì)，通過對植物葉綠素、光合速率、暗反應(yīng)的主要酶以及光呼吸等的影響直接或間接影響植物光合作用（尹麗等，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)TAV的脫除顯著增加了相同培養(yǎng)天數(shù)時懷白菊葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，顯著提高了懷白菊的NR活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量，且葉綠素a、葉綠素b含量增幅最大值出現(xiàn)的時間（繼代22 d）和NR活力、游離脯氨酸含量最高增幅出現(xiàn)的時間（繼代22 d）相吻合，進一步說明了植物氮代謝與葉綠素含量及光合能力具有相關(guān)性，且TAV脫除有利于提高懷白菊的光合能力和氮代謝水平。

為進一步探討TAV脫除對懷白菊光合及氮代謝的影響，今后還應(yīng)對TAV脫除對懷白菊葉綠素熒光參數(shù)、光合特性參數(shù)（如凈光合速率、氣孔導度等）等指標及NR基因表達等方面進行深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，TAV脫除能夠有效提高懷白菊葉片葉綠素含量及氮代謝水平，利于其生長發(fā)育，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

參考文獻：

陳選陽，陳鳳翔，袁照年，莊寶華，翁定河. 2001. 甘薯脫毒對一些生理指標的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報，30（4）：449-453.

Chen X Y，Chen F X，Yuan Z N，Zhuang B H，Weng D H. 2001. Effect of virus-elimination on some physiological indices in sweet potato[J]. Journal of Fujian Agricultural University，30（4）：449-453.

陳永明，王行，趙偉才，羅慧紅. 2014. 不同烤煙品種成熟期碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，26（8）：43-45.

Chen Y M，Wang X，Zhao W C，Luo H H. 2014. Changes in activity of key enzymes in carbon-nitrogen metabolism of different flue-cured tobacco varieties at mature stage[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，26（8）：43-45.

葛曉霞，劉和，馬曉芳. 2006. 脫毒駿棗幼樹葉片葉綠素含量和光合日變化的研究[J]. 山西林業(yè)科技，（2）：16-17.

Ge X X，Liu H，Ma X F. 2006. The study on chlorophyll contents and day change of photosynthetic in virus-free young jujube tree[J]. Shanxi Forestry Science and Technology，（2）：16-17.

欒愛萍. 2012. 非洲菊莖尖超低溫脫毒及病毒檢測技術(shù)[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學.

Luan A P. 2012. Studies on shoot tip virus elimination by cryopreservation and Gerbera Jamesonii virus detection[D]. Ch-

angsha：Hunan Agricultural University.

李合生. 2000. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社：261-263.

Li H S. 2000. Experimental Principle and Technology of Plant Physiology and Biochemistry[M]. Beijing：Higher Education Press：261-263.

林麗琳，陳晟，施木田，吳宇芬，趙依杰，王俊芳，周慶云，彭密紅. 2015. Mg 對‘黑美人西瓜葉片 C、 N 代謝的影響[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，11（1）：25-30.

Lin L L，Chen S，Shi M T，Wu Y F，Zhao Y J，Wang J F，Zhou Q Y，Peng M H. 2015. Effect of magnesium on carbon and nitrogen metabolism of ‘Heimeiren watermelon leaves[J]. Subtropical Agriculture Research，11（1）：25-30.

陸彬彬. 2004. 低溫對水稻幼苗碳氮代謝相關(guān)酶的影響[D]. 武漢：武漢大學.

Lu B B. 2004. Effect of low temperature on key enzymes involved in ammonium assimilation and carbon metabolism in rice（Oryza sativa L.） seedlings[D]. Wuhan：Wuhan University.

宋新穎，鄔爽，張洪生，林琪，穆平. 2014. 土壤水分脅迫對不同品種冬小麥生理特性的影響[J]. 華北農(nóng)學報，29（2）：174-180.

Song X Y，Wu S，Zhang H S，Lin Q，Mu P. 2014. Effect of soil water stress on physiological characteristics in different winter wheat cultivars[J]. Acta Agriculturae Boreali Sinica，29（2）：174-180.

孫菲菲，李建剛，王夏，王強，侯喜林. 2014. 不結(jié)球白菜氮代謝關(guān)鍵酶在不同氮素條件下的表達分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，30（4）：848-854.

Sun F F，Li J G，Wang X，Wang Q，Hou X L. 2014. Expression analysis of genes encoding enzymes related to nitrogen metabolism in non-heading Chinese cabbage[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science，30（4）：848-854.

唐秀梅，鐘瑞春，揭紅科，蔣菁，熊發(fā)前，黃志鵬，賀梁瓊，李忠，韓柱強，唐榮華. 2014. 間作木薯對花生葉片碳氮代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，27（6）：2316-2321.

Tang X M，Zhong R C，Jie H K，Jiang J，Xiong F Q，Huang Z P，He L Q，Li Z，Han Z Q，Tang R H. 2014. Effect of cassava-peanut intercropping on metabolites and key enzyme activity of carbon-nitrogen metabolism of peanut leaf[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，27（6）：2316-2321.

王麗花，吳學尉，楊秀梅，翟素萍，王繼華，莫錫君. 2012. 香石竹斑駁病毒（CarMV）脫除對幾種生理指標的影響[J]. 植物生理學報，48（3）：247-250.

Wang L H，Wu X W，Yang X M，Zhai S P，Wang J H，Mo X J. 2012. Production of CarMV-free carnation plants and its effects on some physiological indicators[J]. Plant Physiology Journal，48（3）：247-250.

吳玉霞. 2008. 蘋果脫毒試管苗和普通試管苗生理生化特性比較研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學.

Wu Y X. 2008. Studies on the physiological and biochemical characters of virus-free and common apple in vitro[D]. Lan-

zhou：Gansu Agricultural University.

薛建平，張愛民，盛瑋，張國旺. 2004. 安徽藥菊脫毒苗與非脫毒苗生理生化的比較研究[J]. 中國中藥雜志，29（6）：514-517.

Xue J P，Zhang A M，Sheng W，Zhang G W. 2004. Comparative study on physiological and biochemical mechanism between virus-free seedling and common seedling in Chrysanthemum morrifolium from Anhui[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，29（6）：514-517.

尹麗，胡庭興，劉永安，謝財永，馮毅，顏震，李銀華，王永杰. 2011. 施氮量對麻瘋樹幼苗生長及葉片光合特性的影響[J]. 生態(tài)學報，31（17）：4977-4984.

Yin L，Hu T X，Liu Y A，Xie C Y，F(xiàn)eng Y，Yan Z，Li Y H，Wang Y J. 2011. Effect of nitrogen application rate on growth and leaf photosynthetic characteristics of Jatrophacurcas L. seed-

lings[J]. Acta Ecologica Sinica，31（17）：4977-4984.

張國民，王連敏，王立志，宋立泉，張玉華，徐麗梅. 2000. 苗期低溫對玉米葉綠素含量及生長發(fā)育的影響[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，（1）：10-12.

Zhang G M，Wang L M，Wang L Z，Song L Q，Zhang Y H，Xu L M. 2000. The effect of low temperature on chlorophyll content and growth of maize at seedling stage[J]. Heilongjiang Agricultural Science，（1）：10-12.

張智猛，張威，胡文廣，矯巖林，王磊，李偉芳. 2006. 高產(chǎn)花生氮素代謝相關(guān)酶活性變化的研究[J]. 花生學報，35（1）：8-12.

Zhang Z M，Zhang W，Hu W G，Jiao Y L，Wang L，Li W F. 2006. Study on enzymatic activity correlative with nitrogen meta-

bolism in high-yield peanut[J]. Journal of Peanut Science，35（1）：8-12.

趙喜亭，宋萍萍，王苗，趙月麗，郭婧，李明軍. 2011. 玻璃化超低溫保存對懷菊花再生苗形態(tài)及生理的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，50（3）：533-535.

Zhao X T，Song P P，Wang M，Zhao Y L，Guo J，Li M J. 2011. Effect of cryopreservation by vitrification on morphology and physiology of Huaiqing chrysanthemum（Dendranthema morifolium） regeneration plantlets[J]. Hubei Agricultural Sciences，50（3）：533-535.

趙喜亭，田瑩，周穎媛，范子建，朱玉婷，蔣麗微，李明軍. 2015. 番茄不孕病毒（TAV）脫除對‘懷白菊活性氧代謝的影響[J]. 植物生理學報，51（10）：1757-1763.

Zhao X T，Tian Y，Zhou Y Y，F(xiàn)an Z J，Zhu Y T，Jiang L W，Li M J. 2015. Effect of TAV-free on active qxygen metabolism of chrysanthemum morifolium‘Huaibai[J]. Plant Physiology Journal，51（10）：1757-1763.

周全盧，張玉娟，黃迎冬，李育明，何素蘭，楊洪康，劉莉莎，王梅. 2014. 甘薯病毒病復合體（SPVD）對甘薯產(chǎn)量形成的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，30（1）：42-46.

Zhou Q L，Zhang Y J，Huang Y D，Li Y M，He S L，Yang H K，Liu L S，Wang M. 2014. Effect of sweet potato virus disease（SPVD） on sweet potato yield formation[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science，30（1）：42-46.

Budiarto K. 2013. Elimination of Cucumber mosaic virus（CMV）from a range of chrysanthemum cultures through meristem culture following heat treatment[J]. Journal Hamadan Penyakit Tumbuhan Tropika，11（1）：28-34.

Miller A J，Cramer M D. 2004. Root nitrogen acquisition and assimilation[J]. Plant and Soil，274（1）：1-36.

Wang Q，Valkonen J P T. 2009. Cryotherapy of shoot tips：novel pathogen eradication method[J]. Trends in Plant Science，14（3）：119-122.

Zhao X T，Liu X X，Hong B. 2015. Characterization of tomato aspermy virus isolated from chrysanthemum and elucidation of its complete nucleotide sequence[J]. Acta Virologica，59（2）：204-206.

（責任編輯 王 暉）