利用EMS進(jìn)行茄子種質(zhì)資源創(chuàng)新

肖熙鷗 林文秋 李威 劉國強(qiáng) 張曉虹 呂玲玲

摘要：【目的】利用EMS誘變進(jìn)行茄子種質(zhì)資源創(chuàng)新，為茄子新品種選育及其相關(guān)基因功能研究提供良好材料?！痉椒ā吭?5 ℃下利用不同濃度（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的EMS溶液誘變處理茄子種子，篩選出適宜的EMS誘變濃度；然后以適宜濃度的EMS誘變液處理茄子種子，經(jīng)過催芽后播種、定植，在植株的整個(gè)生育期進(jìn)行相關(guān)性狀調(diào)查?！窘Y(jié)果】以1.0% EMS誘變處理18 h后，茄子種子的發(fā)芽率可達(dá)80%，適宜構(gòu)建茄子突變體庫。20 g茄子種子經(jīng)1.0% EMS誘變處理18 h后催芽播種，最終獲得984份M1代突變材料，且這些突變材料在長勢(shì)、葉片形狀、葉片顏色、分枝數(shù)、果實(shí)長度、果實(shí)顏色及雄性不育等方面表現(xiàn)出豐富的變異?！窘Y(jié)論】經(jīng)EMS誘變處理獲得的M1代茄子表現(xiàn)出豐富的變異，可為其新品種選育及基因功能研究提供良好材料。

關(guān)鍵詞： 茄子；EMS誘變；種質(zhì)資源；性狀突變；創(chuàng)新

中圖分類號(hào)： S641.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）08-1247-07

Abstract：【Objective】In order to provide fine resources for breeding of new eggplant variety and research of its gene function， the germplasm resources of eggplant were innovated by EMS mutagenesis. 【Method】Under 25 ℃ condition， the eggplant seeds was mutagenized by different concentrations of EMS（0%， 0.5%， 1.0%， 1.5% and 2.0%）， respectively， so as to select optimal EMS concentration. Then the eggplant seed was mutagenized by EMS. After accelerating germination， the seedlings were transplanted to field. The mutant traits were investigated during growth period. 【Result】After being mutagenized by 1.0% EMS for 18 h， the seed germination rate was 80%， which indicated that 1% EMS was suitable for construction of EMS mutants library. A total of 984 M1 generation mutants were gained after 20 g eggplant seeds was mutagenized by 1.0% EMS. There were remarkable variations in plant growth， leaf shape， leaf color， fruit length， fruit color， fruit-bearing character and male sterile of these mutants. 【Conclusion】The M1 generation eggplant gained by EMS mutagenesis is suitable for eggplant variety breeding and gene function research because it shows abundant variations.

Key words： eggplant； EMS mutation； germplasm resource； trait mutation； innovation

0 引言

【研究意義】茄子（Solanum melongena L.）原產(chǎn)于印度，其栽培種的遺傳背景相對(duì)狹窄（肖熙鷗等，2012；馮英娜等，2014），且由于不同地區(qū)間的種質(zhì)資源不斷交流，導(dǎo)致茄子種質(zhì)同質(zhì)化嚴(yán)重，遺傳多樣性減少（廖毅等，2009）。隨著茄子基因組測序的完成（Hirakawa et al.，2014），茄子的研究逐步進(jìn)入后基因組時(shí)代。與圖位克隆相比，以突變體庫為基礎(chǔ)，利用基因組重測序技術(shù)定位基因具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)（Just et al.，2013；Nordstr■m et al.，2013；Thole and Strader，2015）。此外，利用TILLING（Targeting induced local lesions in genomes）反向篩選突變體，也是目前研究基因功能最有效的手段之一（McCallum et al.，2000；石從廣等，2010）。因此，加強(qiáng)茄子種質(zhì)資源創(chuàng)新，擴(kuò)展其遺傳基礎(chǔ)對(duì)茄子新品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通過化學(xué)、物理、生物及航空誘導(dǎo)等手段能夠顯著提高植物的誘變率（徐明和路鐵剛，2011），如邱正高等（2009）利用航空誘變，獲得了玉米矮桿突變體；Saito等（2011）利用Co60照射誘變番茄獲得了豐富的突變體，成功構(gòu)建了番茄的突變體庫。甲基磺酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS）是最常用的誘變劑，因具有誘變效率高且不易造成染色體畸變的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于構(gòu)建突變體庫。在種質(zhì)創(chuàng)新方面，已在油菜（石從廣等，2010；張鳳啟等，2010）、水稻（邱福林，2007；Takagi et al.，2013）、小麥（徐艷花等，2010；Zhang et al.，2015）等作物上應(yīng)用EMS誘變成功構(gòu)建了突變體庫，這些突變體為種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育提供了良好的材料。在基礎(chǔ)研究方面，已利用EMS突變體克隆獲得多個(gè)與植物重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因，如Takagi等（2013）利用水稻突變體克隆了水稻耐鹽基因（hst），Zhou等（2015）利用黃瓜突變體克隆了控制果色的ARC5基因。可見，EMS突變體為基因資源的利用及輔助育種奠定了良好基礎(chǔ)（Abe et al.，2011；Takagi et al.，2013，2015）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，茄子種質(zhì)資源的創(chuàng)新主要是利用常規(guī)雜交、遠(yuǎn)緣雜交等（曹必好等，2009；王益奎等，2015），而利用EMS誘導(dǎo)進(jìn)行茄子種質(zhì)創(chuàng)新的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以穩(wěn)定遺傳的茄子自交系為材料，探究不同EMS濃度對(duì)茄子發(fā)芽率的影響，建立茄子EMS誘變體系，并利用建立的體系誘變茄子種子進(jìn)行種質(zhì)資源創(chuàng)新，以期為茄子新品種選育和基因功能研究提供良好的材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

以遺傳穩(wěn)定的自交系E31-1為試驗(yàn)材料，其果實(shí)呈棒狀，果皮紫色，果長約35 cm，花冠紫色，高抗青枯病。選取顆粒飽滿、無病變的種子進(jìn)行EMS誘變。EMS（產(chǎn)品號(hào)M880-5g）購自美國Sigma公司。

1. 2 誘變體系建立

利用磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）配制不同濃度的EMS誘變液（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%），將100粒茄子種子置于10 mL EMS誘變液中，25 ℃下?lián)u床（100 r/min）處理18 h后，利用5%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，清水沖洗3～4次，洗凈種子表面上的殘留物。然后28 ℃下催芽，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，20 d后仍未發(fā)芽的種子視為不發(fā)芽。

1. 3 誘變體庫構(gòu)建

利用1.0% EMS誘變液按上述方法處理20 g茄子種子，將催芽的茄子種子播種于50孔穴盤中育苗，1個(gè)月后移栽于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所蔬菜課題組基地，按照常規(guī)管理技術(shù)進(jìn)行栽培管理。田間調(diào)查參考李錫香和朱德蔚（2000）的《茄子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，苗期性狀包括子葉顏色、葉片色、第一片真葉形狀等，開花期性狀包括花瓣顏色、花瓣數(shù)目、花瓣形態(tài)、花冠大小、花序形態(tài)、柱頭外露、育性等，成熟期性狀包括株高、分支數(shù)、果實(shí)大小、果實(shí)顏色、坐果數(shù)等。

2 結(jié)果與分析

2. 1 EMS誘變對(duì)茄子種子發(fā)芽率的影響

EMS誘變效果受其濃度、處理時(shí)間、處理溫度等外界條件的影響。為了平衡突變率與致死率間的關(guān)系，需確定適宜的EMS誘變濃度。由圖1可知，隨著EMS濃度的升高，種子發(fā)芽率快速下降，當(dāng)誘變濃度達(dá)2.0%時(shí)幾乎不萌發(fā)。EMS誘變濃度影響種子發(fā)芽率的同時(shí)，也影響種子的發(fā)芽勢(shì)。在本研究中，使用磷酸緩沖液處理的茄子種子（對(duì)照組）在催芽后5 d開始萌發(fā)，至第10 d時(shí)基本萌發(fā)完全（發(fā)芽率98%），而經(jīng)1.0% EMS誘變處理后，茄子種子在第10 d開始萌發(fā)（圖2），至第16 d時(shí)才基本萌發(fā)完全，發(fā)芽率為80%。因此，選擇1.0% EMS進(jìn)行茄子種質(zhì)資源創(chuàng)新。

2. 2 苗期性狀調(diào)查結(jié)果

20 g茄子種子經(jīng)1.0% EMS誘變處理18 h后催芽播種，最終得到2135株幼苗。苗期調(diào)查結(jié)果顯示，茄子幼苗的子葉大小、顏色等表現(xiàn)出豐富的變異性（圖3）。其中，95.32%植株的第一片真葉表現(xiàn)出突變，但第二片真葉恢復(fù)正常。

2. 3 植株長勢(shì)調(diào)查結(jié)果

定植的2135株幼苗受臺(tái)風(fēng)危害后僅剩余984份材料，其性狀表現(xiàn)出豐富的變異。984株M1代茄子的長勢(shì)在整體上極不均勻，與對(duì)照組相比，總體長勢(shì)相對(duì)較弱，其中有11%的植株長勢(shì)受到嚴(yán)重抑制。此外，有35株M1代茄子表現(xiàn)為植株退化且花器形成較晚，1株M1代茄子表現(xiàn)為節(jié)間短縮。

2. 4 葉片性狀調(diào)查結(jié)果

M1代群體的葉片大小、顏色形狀均已發(fā)生豐富變異（表1，圖4），共有3株植株葉片表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，且均為嵌合體。其中，1株植株的一半葉片發(fā)生黃化（圖5-A），1株僅有兩片葉片部分黃化（圖5-B），1株的整體黃化程度較輕，僅表現(xiàn)為新生葉片呈黃綠色（圖5-C）。在葉片大小變異方面，葉片退化突變體的頻率最高（3.56%）（圖4-B），其次為葉片變小（2.13%）（圖4-C），僅1.12%的葉片變大（圖4-D）。除了葉片黃化外，有13株植株的葉片紫色加深（圖4-E），同時(shí)存在葉緣（圖4-F）和葉尖（圖4-G）等形狀發(fā)生變異。

2. 5 果實(shí)性狀調(diào)查結(jié)果

野生型茄子果實(shí)長約35 cm，紫色，棒狀，果頂圓。M1代群體在果實(shí)的大小、長度、顏色和形狀等方面均表現(xiàn)出豐富的變異（表2），共有70株表現(xiàn)出明顯的變異，突變頻率為7.11%。其中，果實(shí)性狀變異頻率最高的為果實(shí)變粗（圖6-A），其次為果實(shí)變短（圖6-B），有22株M1代茄子的果實(shí)同時(shí)變短變粗。4株M1代茄子果實(shí)明顯變長（圖6-C和圖6-D），達(dá)37～47 cm；6株M1代茄子材料表現(xiàn)出兩個(gè)果實(shí)并生畸形（圖6-E）。在果實(shí)顏色的突變體中，有2株M1代茄子果實(shí)呈深黑色，色澤光亮（圖6-F）。3株M1代茄子資源果頂變尖（圖6-G）。果實(shí)是茄子的商品器官，其形狀、色澤對(duì)商品性有著重要意義，同時(shí)果實(shí)的長度、粗度是構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素，M1代群體中果實(shí)性狀的有利突變體可作為品種改良的基礎(chǔ)材料。

2. 6 莖桿性狀調(diào)查結(jié)果

由于EMS對(duì)植物生長具有抑制作用，因此未進(jìn)行植株的株高、株幅調(diào)查，而僅針對(duì)其分枝情況進(jìn)行調(diào)查。野生型植株第1次分枝在距離地面35～40 cm，而在M1代中有160株植株的第1分枝節(jié)位變矮，主要分布在10～20 cm（圖7-A）。除了分枝節(jié)位變矮外，分枝數(shù)量也出現(xiàn)變異，有7株M1代茄子出現(xiàn)3個(gè)分枝（圖7-B），有2株表現(xiàn)為4個(gè)分枝。分枝節(jié)位的變低及分枝數(shù)增加，有利于茄子早熟和增產(chǎn)。

2. 7 花器性狀調(diào)查結(jié)果

花器的變異最少，在調(diào)查的984株突變體中僅發(fā)現(xiàn)2株雄性不育材料。初步形態(tài)觀察推斷，1株表現(xiàn)為雄蕊退化，另外一株表現(xiàn)為花粉敗育，其不育機(jī)理有待進(jìn)一步探究。此外，1株植株中的側(cè)枝花朵變白，萼片變綠；1株植株與其他突變體相比，約提早開花7 d。

2. 8 坐果性狀調(diào)查結(jié)果

野生型植株主要為單個(gè)坐果，而在突變體中出現(xiàn)集中坐果的突變株。集中坐果的突變植株主要表現(xiàn)為三大類：一是分枝多，每個(gè)分枝同時(shí)坐果（圖8-A）；二是坐果的節(jié)位集中，一個(gè)節(jié)位一個(gè)果，茄子坐果集中（圖8-B）；三是同一節(jié)位坐2～3個(gè)果實(shí)（圖8-C）。

3 討論

突變體的構(gòu)建需要解決兩個(gè)問題；一是產(chǎn)生足夠的突變，二是突變能夠遺傳給后代。EMS誘變濃度、處理時(shí)間是影響其誘變效果的主要因素。張鳳啟等（2010）認(rèn)為0.4% EMS處理12 h對(duì)甘藍(lán)型油菜的誘變效果最佳；李文慧（2014）利用0.8% EMS處理番茄24 h后成功獲得含有豐富突變性狀的突變體庫。在本研究中，以1.0% EMS處理18 h后的種子發(fā)芽率為80%，可能是由于茄子種子相對(duì)較大、種皮較厚，因此需要較高濃度的EMS誘變才能產(chǎn)生豐富的突變體。經(jīng)EMS誘導(dǎo)處理后，茄子不同生理表觀性狀發(fā)生突變的頻率也不同，在984份M1代植株中，有160株M1代茄子的第1分枝節(jié)位變矮，變異頻率最高，而花器的變異頻率最低，僅有4株植株表現(xiàn)出變異。但在甘藍(lán)型油菜中，花器性狀的突變類型豐富，突變頻率最高（孫加焱等，2007；張鳳啟等，2010）。這可能是由于高突變率的性狀受多個(gè)基因調(diào)控，突變頻率低的性狀僅受少數(shù)基因調(diào)控。

EMS誘變產(chǎn)生的M1代隱性突變較多，少量為顯性突變，即大多數(shù)突變性狀在M1代不會(huì)表現(xiàn)，但在M2代會(huì)表現(xiàn)出突變性狀，因此當(dāng)前利用MutMap技術(shù)克隆控制重要農(nóng)藝性狀及TILLING技術(shù)反向篩選突變時(shí)主要是利用M2代群體（Aba et al.，2011；Kurowska et al.，2011）。本研究僅調(diào)查了M1代群體的相關(guān)性狀，因此需對(duì)M1代進(jìn)行單株留種，在M2代進(jìn)行重點(diǎn)考察。以EMS進(jìn)行誘變不僅能開展種質(zhì)創(chuàng)新和基因功能研究，利用突變體與常規(guī)育種手段相結(jié)合還能加速品種選育的進(jìn)程（Takagi et al.，2015）。本研究中使用的材料為茄子高代自交系，遺傳穩(wěn)定，綜合性狀優(yōu)良，具有潛在的利用價(jià)值，對(duì)其誘變體進(jìn)行自交2～3代可獲得表現(xiàn)優(yōu)良的株系（純合體），既可作為雜交育種的親本，又能作為常規(guī)種直接用于生產(chǎn)，進(jìn)而縮短育種年限。

4 結(jié)論

經(jīng)EMS誘變處理獲得的M1代茄子表現(xiàn)出豐富的變異，可為其新品種選育及基因功能研究提供良好材料。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）