中國常用橡膠樹品種鑒定方法研究

王生瑞 王師笈 朱軍 黃家權(quán)

摘 要 橡膠樹（Hevea brasiliensis）產(chǎn)生的膠乳是天然橡膠的最重要來源，不同品種產(chǎn)生膠乳的能力不同，但不同的橡膠樹品種形態(tài)差異小，難以區(qū)分。利用簡單的方法區(qū)分不同的橡膠樹品種具有重要的意義。以天然橡膠生物合成相關(guān)的7個基因家族中的目的基因及啟動子序列為模板，設(shè)計基因特異的PCR引物16對，分別擴(kuò)增21個橡膠樹栽培品種的基因組DNA，擴(kuò)增條帶的多態(tài)性可將19個品種區(qū)分開（除了云研77-4和南華1號外）。再利用橡膠小粒子編碼蛋白基因（SRPP2）特異的引物，擴(kuò)增云研77-4和南華1號的SRPP2基因，PCR反應(yīng)產(chǎn)物直接測序，通過單核苷酸水平上的差異可準(zhǔn)確的將二者區(qū)分開。本研究通過簡單的PCR擴(kuò)增及其擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序，建立了一種穩(wěn)定性好、簡單快速、經(jīng)濟(jì)高效的鑒定橡膠樹品種的方法。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；克隆；引物設(shè)計；品種鑒定；單核苷酸差異

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The latex of the rubber tree（Hevea brasiliensis） is the most important source of natural rubber. The ability of latex production and adaptability of different rubber tree clones varied greatly， however， it is difficult to distinguish clones based on morphological traits， which is an important task in field work. In this study， sixteen pairs of gene specific primers were designed basing on gene and promoter sequences of genes related to natural rubber biosynthesis， these primer pairs were used respectively to amplify the genomic DNA of 21 rubber tree clones widely grown in China. The results showed that banding profile of these primer pairs could distinguish the 19 rubber tree clones， except Yunyan77-4 and Nanhua1. PCR amplification products using gene（SRPP2 encoding small rubber particle protein）specific primers were used for sequencing analysis， these two clones could be distinguished based on single nucleotide differences. In this study， a simple， stable and cost effective method using PCR band profile and PCR product sequencing to identify rubber tree clones was established.

Key words Rubber tree；Clone；Primer design；Clone identification；Single nucleotide difference

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.001

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于巴西亞馬遜河流域赤道氣候帶，為多年生喬木，是典型的熱帶雨林樹種。天然橡膠是橡膠樹的次生代謝物，具有耐高溫和高彈性等突出優(yōu)點，是世界性工業(yè)原料和重要的戰(zhàn)略物資，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值及應(yīng)用前景。在2 000多種產(chǎn)膠植物中，橡膠樹是唯一大規(guī)模商業(yè)化種植的產(chǎn)膠植物。近年來，隨著世界對天然橡膠需求量的不斷增加，橡膠樹栽培面積也迅速擴(kuò)大。中國是天然橡膠的消費(fèi)和生產(chǎn)大國，自1906年起就開始種植橡膠樹，但受自然條件限制，橡膠樹僅分布在海南、廣東、云南等地。

目前世界上栽培的橡膠樹品種均來自魏克漢種質(zhì)，并通過引種、雜交等育種手段，選育和推廣了多個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的橡膠樹品種。中國在生產(chǎn)中也使用了大量的橡膠樹品種，僅中國栽培的橡膠樹就超過了20種，并且早在20世紀(jì)70年代引進(jìn)的RRIM600仍然在廣泛種植。為了加快品種的更新?lián)Q代，了解不同橡膠樹品種的分布，以及在進(jìn)行野外調(diào)查時確定調(diào)查對象的遺傳背景，需要簡單、快速、準(zhǔn)確的橡膠樹品種鑒定方法。

植物品種鑒定方法主要包括形態(tài)學(xué)鑒定法、物理化學(xué)鑒定法、生化鑒定法和DNA分子標(biāo)記指紋圖譜鑒定法等[1]。目前國內(nèi)外品種鑒定仍以形態(tài)學(xué)鑒定為主，但形態(tài)標(biāo)記的表現(xiàn)受環(huán)境影響較大、鑒定工作量大、周期長、受季節(jié)限制[2-3]，并且橡膠樹不同材料之間的差別較小，對普通的工作者而言，難以區(qū)分。近年來，分子標(biāo)記方法（RFLP、AFLP、SSR、ISSR、SRAP、TRAP、SNP）的開發(fā)和利用在作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定等方面的研究取得了一定的研究進(jìn)展[4-5]，這些技術(shù)可被用來有效的區(qū)分不同的品種，但這些技術(shù)的操作技術(shù)復(fù)雜，對DNA質(zhì)量要求高，時間長，費(fèi)用相對較高[6-7]。因此，亟需開發(fā)穩(wěn)定性好、簡單快速、經(jīng)濟(jì)高效的橡膠樹品種鑒定方法。

本研究以天然橡膠生物合成相關(guān)的7個基因家族中的部分目的基因及啟動子序列為模板，設(shè)計16對特異性擴(kuò)增引物，對中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)圃保存的且在中國生產(chǎn)上廣泛利用的21份魏克漢種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合PCR產(chǎn)物測序，以期建立一種簡單快速、穩(wěn)定且經(jīng)濟(jì)高效的橡膠樹品種鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所有的橡膠樹材料均來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)圃。采集橡膠樹淡綠期的幼葉，鋁箔包裹，作好記號后，放入液氮罐中帶回實驗室，置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，共采?1個在中國栽培面積較大品種的葉片（表1）。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹DNA提取 參照鐘淦彬等[8]的方法，采用改良的CTAB法提取橡膠樹幼嫩葉片的總DNA。

1.2.2 PCR反應(yīng)及電泳檢測 以巴西橡膠樹天然橡膠生物合成（甲羥戊酸途徑）相關(guān)的7個基因家族[9]中的目的基因及其啟動子區(qū)序列為模板，設(shè)計16對引物（表2），由上海生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中正向和反向引物各1 μL（20 μmol/L），10xTrans Taq HiFi Buffer 2 μL，模板DNA 1 μL（50 ng/μL），2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，HiFi DNA Polymerase 0.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所有材料和引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和條件均一致，反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，在UVitec凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與遺傳相似性分析 對PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜進(jìn)行條帶統(tǒng)計分析，根據(jù)是否擴(kuò)增出條帶，轉(zhuǎn)換為0、1數(shù)據(jù)，并利用NTSYS軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 單核苷酸多態(tài)性分析 利用SRPP2基因特異引物對云研77-4和南華1號進(jìn)行PCR反應(yīng)，將獲得的產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測序（上海生物工程有限公司），每個樣品至少進(jìn)行4次PCR產(chǎn)物測序，以保證基因測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，然后用DNAMAN進(jìn)行序列的拼接，并與GenBank上登錄的SRPP2的cDNA序列（AY237009.1，來自于橡膠樹A775）做多重序列比對，以探測單核苷酸序列的多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析

本研究共使用25對引物，其中16對引物可在不同樣本中擴(kuò)增出清晰的條帶（表2和表3）。引物REF1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠的分離結(jié)果顯示條帶清晰，無雜質(zhì)，大小一致，除6、8、9、16號樣本未擴(kuò)增出條帶，剩余樣本均可擴(kuò)增出清晰可見的條帶（圖1）。引物SRPP3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠的分離結(jié)果顯示條帶清晰，無雜質(zhì)，大小一致，除9號樣本未擴(kuò)增出條帶，剩余樣本均可擴(kuò)出清晰可見的條帶（圖2）。結(jié)果表明，16對特異性引物在21份供試材料中共擴(kuò)增出條帶183條，大小約為1 000～2 000 bp，用同一對引物在不同品種橡膠樹中擴(kuò)增結(jié)果不同，同一個品種用全部引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)目也不同，具有一定的擴(kuò)增多態(tài)性，可進(jìn)一步的統(tǒng)計分析。

2.2 品種間的遺傳相似性分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，利用16對基因特異性引物擴(kuò)增不同DNA樣本，不同遺傳背景的樣本間具有明顯的差異，同一對引物在不同品種橡膠材料中擴(kuò)增出的條帶數(shù)目變化很大，而條帶大小基本一致，如引物SRPP3能在除RRIC 52外的其余20個品種中擴(kuò)增出清晰可見的條帶，引物HS1/HS2和SUT5-2只能在PB86中擴(kuò)增出清晰可見的條帶，在其他品種中均未能擴(kuò)增出條帶。不同品種樣本利用全部特異性引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)目也不同，如PB86用全部引物可擴(kuò)增出14條條帶，RRIC52用全部引物只能擴(kuò)增出1條條帶（表3）。利用統(tǒng)計分析出的數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，大部分品種（除云研77-4和南華1號外）存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶型的差異，可直接通過多個PCR反應(yīng)，根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無加以區(qū)分（圖3），但云研77-4和南華1號使用這些引物擴(kuò)增的結(jié)果沒有差異，不能被區(qū)分開。

2.3 單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析

為了準(zhǔn)確區(qū)分云研77-4和南華1號，利用基因特異性引物SRPP2對云研77-4和南華1號進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得的產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測序，然后利用DNAMAN進(jìn)行序列的拼接，并與引物SRPP2在GenBank中登陸的cDNA序列（AY237009.1）進(jìn)行多重序列比對。共考察了SRPP2的3個區(qū)域，包括2個內(nèi)含子區(qū)和1個外顯子區(qū)，分別定義為Intron1、Exon、Intron2，Intron1（505 bp）中共有33個位點發(fā)生堿基突變，Exon（513 bp）中也有6個位點發(fā)生堿基突變，3個位點發(fā)生堿基缺失，Intron2 （335 bp）中有10個處位點發(fā)生堿基突變?？傮w而言，內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生的堿基突變位點顯著多于外顯子區(qū)域（表4）。根據(jù)云研77-4和南華1號在等位基因SRPP2上的單核苷酸多態(tài)性，可將二者區(qū)分開。

3 討論與結(jié)論

目前，中國和東南亞各植膠國的橡膠樹栽培品種主要是由魏克漢從原產(chǎn)地亞馬遜河流域引種的22株野生種質(zhì)馴化繁衍而成的，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。而中國的自育品種絕大多數(shù)又都可追溯到從東南亞引進(jìn)的少數(shù)幾個無性系，如 PR107、RRIM600等，因此中國橡膠樹品種的遺傳基礎(chǔ)更加狹窄[10]。在本研究中21個無性系的相似系數(shù)變異范圍僅為0.60～1.00，也證明了這一點。雖然有經(jīng)驗的研究人員可通過形態(tài)學(xué)的差異區(qū)分不同橡膠樹品種，但不同品種之間的形態(tài)學(xué)的差異較小，并且受環(huán)境因素的影響。從分子水平上對橡膠樹品種進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定，能為橡膠樹遺傳育種前期的品種鑒定工作提供幫助，對橡膠樹種質(zhì)資源的保護(hù)、橡膠樹野外品種調(diào)查等工作均具有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

一種理想的作物品種分子鑒定方法應(yīng)具有以下特點：多態(tài)性高；重復(fù)性和穩(wěn)定性好；帶型清晰，容易統(tǒng)計；在染色體上均勻分布；共顯性；簡單快速，易自動化；標(biāo)準(zhǔn)化；開發(fā)和使用成本低廉[11-12]。目前報道的同一種作物的品種鑒定多利用PCR技術(shù)。因此，適宜的PCR反應(yīng)體系及其優(yōu)化利用是作物品種分子鑒定技術(shù)的研究內(nèi)容之一[13-14]。雖然許多傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)方法均已被用來鑒定不同作物的品種，但在實際操作中，由于DNA用量大，耗費(fèi)成本高，操作繁瑣，不能簡單快速的區(qū)分不同的品種[15-16]。本研究中所采用的鑒定橡膠品種的方法，只需獲得少量的基因組DNA，設(shè)計基因特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用瓊脂糖電泳檢測及PCR產(chǎn)物測序，最多1周時間就可完成橡膠樹品種的快速鑒定，在本過程中，標(biāo)準(zhǔn)化的PCR反應(yīng)體系保證了結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性，方法操作非常簡單且費(fèi)用較低，條帶清晰明顯，可靠性高，在大部分的實驗室就能完成。由于本研究選用的是基因特異的PCR擴(kuò)增，不能從基因組的水平來區(qū)分不同品種，同時，少部分品種利用本研究設(shè)計的基因特異引物也不能區(qū)分，在今后的工作中，可通過增加目標(biāo)基因的擴(kuò)增來實現(xiàn)，但同時也可通過對單個基因的序列進(jìn)行分析，獲得差異化的snp位點，從而達(dá)到區(qū)分不同品種的目的。

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