白細(xì)胞介素1β和核因子κB相關(guān)免疫通路在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病合并抑郁中的作用

潘江其　于　璐　唐鮮娥　馬文林　石煒祺　鄧　良　趙翠梅　楊　凡

200092上海，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院(潘江其，于 璐，唐鮮娥)；200065上海，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科

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白細(xì)胞介素1β和核因子κB相關(guān)免疫通路在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病合并抑郁中的作用

潘江其于璐唐鮮娥馬文林石煒祺鄧良趙翠梅楊凡

200092上海，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院(潘江其，于 璐，唐鮮娥)；200065上海，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科

【摘要】目的：通過(guò)檢測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease, CAD)合并抑郁患者的免疫功能，探索疾病之間的免疫學(xué)關(guān)系。方法：連續(xù)收集173例CAD患者，運(yùn)用患者健康量表-9(patient health questionnaire-9, PHQ-9)對(duì)已確診的CAD患者進(jìn)行抑郁癥狀評(píng)估。根據(jù)PHQ-9評(píng)分將患者分為情緒正常組(0≤PHQ-9評(píng)分<5)、輕度抑郁組(5≤PHQ-9評(píng)分<10分)、中度抑郁組(10≤PHQ-9評(píng)分≤14分)、中重度及重度抑郁組(15≤PHQ-9評(píng)分≤27)，同期檢測(cè)所有入組者免疫功能指標(biāo)。將不同程度抑郁患者血清與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng),采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和核因子κB(NF-κB)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果：CAD伴中重度以上抑郁患者的 IL-1β血清水平[11.73(9.40,17.46) ng/L]顯著高于輕度抑郁[8.97(6.07, 11.28)ng/L]及情緒正常患者[8.14(6.17, 9.80)ng/L], P<0.05。CAD伴中重度抑郁患者的血清可激活HUVEC細(xì)胞，且其IL-1β、NF-κB基因表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論：炎性免疫機(jī)制可能為CAD與伴發(fā)抑郁之間的內(nèi)在聯(lián)系之一，IL-1β、NF-κB相關(guān)免疫通路可能為核心機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病;抑郁;白細(xì)胞介素-1β

抑郁是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，可顯著降低患者的生活質(zhì)量，增加CAD發(fā)病率和死亡率[1-3]。CAD合并抑郁尚缺乏有效治療方法，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。研究顯示，CAD和抑郁患者均伴有免疫反應(yīng)異常[4-5]。本研究通過(guò)檢測(cè)CAD合并抑郁患者的免疫功能，在細(xì)胞水平探討兩者的免疫學(xué)聯(lián)系。

1對(duì)象及方法

1.1研究對(duì)象

連續(xù)收集2011年1月至2014年5月在同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科住院的CAD患者173例，平均年齡(68.20±11.02)歲，男性112例(64.7%)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)CAD診斷標(biāo)準(zhǔn)遵循指南，即冠狀動(dòng)脈造影顯示冠狀動(dòng)脈狹窄程度>50%,或既往有明確心肌梗死病史；(2)合并抑郁標(biāo)準(zhǔn)為患者健康量表-2(patient health questionnaire-2,PHQ-2)中任一個(gè)問(wèn)題回答“是”。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有精神疾病史，認(rèn)知功能異常；(2)有自殺傾向；(3)嚴(yán)重肝腎功能不全；(4)單純焦慮狀態(tài)；(5)左室射血分?jǐn)?shù)<45%,血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定；(6)急、慢性炎性免疫性疾病；(7)活動(dòng)性肝病或不明原因血氨基轉(zhuǎn)移酶持續(xù)升高以及出凝血功能障礙；(8)甲狀腺功能減退。

1.2研究方法

1.2.1CAD患者抑郁篩查及抑郁程度評(píng)估使用PHQ-2對(duì)所有入組的CAD患者進(jìn)行抑郁篩查，對(duì)其中任何1個(gè)問(wèn)題回答“是”則提示該患者有抑郁癥狀。抑郁程度評(píng)估依據(jù)PHQ-9評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將研究對(duì)象分為情緒正常組(PHQ-9評(píng)分<5分)、輕度抑郁組(PHQ-9評(píng)分為5～9分)、中度抑郁組(PHQ-9評(píng)分為10～14分)、中重度及重度抑郁組(PHQ-9評(píng)分15～27分)[6]。

1.2.2免疫功能檢測(cè)患者病情穩(wěn)定后，于清晨抽取空腹靜脈血，以乙二胺四乙酸-鈉鹽(EDTA-Na)抗凝管于-80℃保存。采用免疫比濁法分析免疫球蛋白(Ig)G、IgM、IgA、補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定白細(xì)胞分化抗原(CD)3、CD4、CD8、CD4/CD8、自然殺傷細(xì)胞(NK)、CD19、CD25、CD28。1.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)包括轉(zhuǎn)染質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染后熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)3個(gè)部分。分別從人基因組中擴(kuò)增IL-1β及核因子κB(NF-κB)DNA啟動(dòng)子序列，克隆至pGL3熒光素酶報(bào)告載體中。IL-1β正向引物序列為CGC CTCGAG CTGGAGCAGGCACTTTGCTGGTGTC， IL-1β反向引物序列為CGC CTCGAG GTGCCTTGTGCCTCGAAGAGGTTTG。NF-κB質(zhì)粒由楊江華實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。在24孔培養(yǎng)板中，利用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)。當(dāng)每孔細(xì)胞數(shù)為4×104時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染液包含100 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液，200 ng的pGL3熒光素酶報(bào)告載體，以10 ng的海膽熒光素酶報(bào)告基因作為對(duì)照，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒后，取10 μL各組患者血清，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)。最后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng) (http://www.promega.com)檢測(cè)細(xì)胞裂解產(chǎn)物中IL-1β和NF-κB熒光素酶的活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1一般資料

在173例CAD患者中，急性心肌梗死者61例(男性72.0%)，不穩(wěn)定心絞痛69例(男性63.7%)，穩(wěn)定心絞痛43例(男性53.5%)。其中伴高血壓者140例(80.9%)，糖尿病者71例(40.6%)，高脂血癥者73例(41.7%)。入組CAD患者中情緒正?；颊?0例，平均年齡(67.04±10.41)歲，構(gòu)成比52.0%，男性70.0%；輕度抑郁患者47例，平均年齡(68.36±11.99)歲，構(gòu)成比27.1%，男性55.3%；中度抑郁患者23例，平均年齡(72.30±10.04)歲，構(gòu)成比13.3%，男性65.2%；中重度及重度抑郁組13例，平均年齡(68.33±12.68)歲，構(gòu)成比7.5%，男性61.5%。4組患者年齡、性別、既往病史、家族史、CAD嚴(yán)重程度均無(wú)顯著性差異。

2.2CAD與抑郁的免疫學(xué)關(guān)系

4組患者的IL-1β水平有顯著差異，在CAD合并抑郁患者中, 血清IL-1β水平隨抑郁程度的增加而升高。其中CAD伴中重度以上抑郁患者的血清IL-1β水平顯著高于輕度抑郁及情緒正?；颊?P<0.05)。其他免疫功能指標(biāo)IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、C3、C4、活化T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞(CD16+CD56+)、CD19+、 CD25+、CD28+在4組患者中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05，見(jiàn)表1)。

表1　不同程度抑郁CAD患者與CAD情緒正常患者免疫功能指標(biāo)的比較

2.3細(xì)胞內(nèi)炎性免疫通路的表達(dá)

熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，加入中度抑郁及以上的CAD患者血清共培養(yǎng)后，HUVEC細(xì)胞IL-1β和NF-κB基因表達(dá)水平顯著升高(見(jiàn)圖1)。

注：*P<0.05圖1　不同抑郁組患者血清與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-1β和NF-κB表達(dá)水平的變化

3討論

CAD合并抑郁的發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)，其中炎癥反應(yīng)機(jī)制為研究的熱點(diǎn)之一，但仍有一定爭(zhēng)議[7-11]。本研究顯示，CAD伴抑郁患者的IL-1β水平顯著高于CAD情緒正常者，且隨抑郁程度增加而升高，這與Dowlati等[12]的研究結(jié)果一致。有多項(xiàng)研究顯示，CAD伴抑郁患者血清TNF-α、IL-6顯著升高[13-15]，而本研究并未觀察到了TNF-α、IL-6、IL-2、IL-4的組間差異。這可能與各研究的入選患者種族、入組標(biāo)準(zhǔn)、抑郁評(píng)價(jià)方法、生物指標(biāo)檢測(cè)方法等不同有關(guān)。CAD伴抑郁患者的血清可激活HUVEC細(xì)胞IL-1β的基因表達(dá)及NF-κB信號(hào)通路，且IL-1β及NF-κB表達(dá)水平隨抑郁程度的增加而升高。

IL-1β主要來(lái)自于激活的單核/巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，是重要的前炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和免疫炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀難治性抑郁大鼠的外周血和海馬IL-1β水平顯著高于氟西汀治療有效的抑郁大鼠和對(duì)照組大鼠，同時(shí)氟西汀難治性抑郁大鼠海馬環(huán)氧化酶2的表達(dá)及前列腺素E2水平均顯著高于對(duì)照組大鼠和氟西汀治療有效大鼠[17]。Lawson等[18]發(fā)現(xiàn)，對(duì)IL-1β轉(zhuǎn)化酶基因敲除小鼠的側(cè)腦室注射脂多糖(LPS)后，在蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中未觀察到抑郁樣行為改變?；谏鲜鰟?dòng)物實(shí)驗(yàn)以及我們的研究結(jié)果，可推測(cè)IL-1β相關(guān)免疫通路可能為CAD與抑郁之間的內(nèi)在聯(lián)系之一，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(收稿：2015-09-29 修回：2016-02-01)

(本文編輯：丁媛媛)

Study of immunologic relationship between depression and coronary artery disease

PANJiangqi1,YULu1,TANGXian’e1,MAWenlin2,SHIWeiqi2,DENGLiang2,ZHAOCuimei2,YANGFan3.

1MedicalSchoolofTongjiUniversity,Shanghai200092; 2DepartmentofCardiology,TongjiHospitalaffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200065; 3DepartmentofClinicalLaboratory,TongjiHospitalaffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200065,China

【Abstract】Objective： To explore the immunologic relationship between depression and coronary artery disease (CAD). Methods： A total of 175 patients were enrolled continuously, and were divided into 4 groups according to the scores of patient health questionnaire-9 (PHQ-9). Immunological function was assessed by measuring serum levels of immunologic factors and immunological cells. The relationship between serum level of immunological factors and degree of depression was analyzed. The human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were co-cultured with the serum of depressed CAD patients, and the expressions of interleukin (IL)-1β and nuclear factor (NF)-κB in HUVEC were measured by luciferase reporter gene detection system.Results： The serum levels of IL-1β were significantly different among 4 groups of patients. Patients with moderate to severe depression have a higher level of IL-1β than those of CAD patients with minimal depression or without depression [11.73(9.40,17.46) ng/L vs. 8.97(6.07, 11.28) ng/L and 8.14(6.17, 9.80) ng/L, P<0.05]. HUVEC co-cultured with the serum of moderate to severely depressed CAD patients expressed greater IL-1β and NF-κB.Conclusion： Immunological inflammation may be one of the pathogenic mechanisms accounting for CAD and depression. IL-1β and NF-κB related pathways may play a key role.

【Key words】Coronary artery disease; Depression; Interleukin-1β

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.02.017

通信作者：馬文林，Email：mawenlin@medmail.com.cn

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生局課題(20114322 )

(馬文林，石煒祺，鄧 良，趙翠梅)；檢驗(yàn)科放射免疫室(楊 凡)