新疆蕪菁水提物抗腫瘤活性初步研究

陳卓爾，古娜娜·對(duì)山別克，烏　英，侯寶林*，海力茜·陶爾大洪*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊　830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊　830000；3.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊　830000)

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新疆蕪菁水提物抗腫瘤活性初步研究

陳卓爾1，古娜娜·對(duì)山別克2，烏英3，侯寶林1*，海力茜·陶爾大洪1*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊830000；3.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊830000)

摘要：目的初步分析新疆蕪菁水提物(BAE)對(duì)Lewis腫瘤的抑制作用。方法利用小鼠Lewis腫瘤移植模型，測(cè)定BAE對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率、脾臟指數(shù)、生命延長(zhǎng)率，并通過(guò)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法)觀察對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果BAE各組瘤質(zhì)量與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，BAE各組脾臟指數(shù)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BAE各組生存時(shí)間與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，同時(shí)初步顯示,BAE對(duì)小鼠體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化也有一定增強(qiáng)作用。結(jié)論新疆蕪菁水提物(BAE)可以增加抑瘤率、脾臟指數(shù)、生命延長(zhǎng)率，并初步說(shuō)明其對(duì)小鼠體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化也有一定增強(qiáng)作用。

關(guān)鍵詞：蕪菁；水提物；抗腫瘤

蕪菁(Brassica rapa L.)，屬于十字花科蕓苔屬蕓苔種，在維吾爾藥中，蕪菁名為恰麻古，是一種藥食兼用植物，臨床用于滋陰潤(rùn)肺，平喘、止咳、清除體內(nèi)異常黏液質(zhì)等異常體液。近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蕪菁具有止咳、祛痰及平喘[1]的功效。在本課題組之前的研究中[2]，已初步鑒定新疆蕪菁水提物(BAE)中含有糖及其苷[3]、黃酮類、氨基酸和蛋白質(zhì)、皂苷、鞣質(zhì)和酚類等成分。本文以新疆蕪菁為原料，首先對(duì)干燥蕪菁藥材進(jìn)行水提[4]，得到蕪菁水提物(BAE)，進(jìn)而初步探討B(tài)AE對(duì)Lewis腫瘤的體內(nèi)抑制作用和體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化(MTT)[5-6]等生物活性，為今后蕪菁藥材的利用和開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；S54紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；TDL80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；CJ-2F 型超凈工作臺(tái) ，蘇州市凈化設(shè)備廠；CO2培養(yǎng)箱，上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EPSON Stylus C65 型酶標(biāo)儀，愛(ài)普生(中國(guó))有限公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)CORNING 公司。

1.2試藥新疆蕪菁，購(gòu)于阿克蘇柯坪縣，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥/天藥教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定，為十字花科蕓苔屬蕓苔種蕪菁(BrassicarapaL.)地下莖。蕪菁水提物(BAE)：實(shí)驗(yàn)室自制的水提物；環(huán)磷酰胺CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20090124；刀豆蛋白A(ConA)，美國(guó)sigma公司；脂多糖(LPS)，美國(guó)sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液，北京天潤(rùn)善達(dá)生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物BALB/C小鼠，體質(zhì)量18～22 g，均為雌性小鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Lewis細(xì)胞株，購(gòu)于上海生命科學(xué)研究院。

2方法

2.1蕪菁水提物(BAE)的制備采用水提法提取蕪菁，提取工藝為：固液比1∶30(g·mL-1)，提取溫度為90 ℃，提取3次，每次2 h。

2.2蕪菁水提物抗Lewis腫瘤的實(shí)驗(yàn)

2.2.1腫瘤模型的建立及分組取BALB/C小鼠72只，皮膚經(jīng)消毒后，將0.2 mL Lewis瘤細(xì)胞液(瘤細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)·mL-1)注射于每只小鼠右前肢腋下，接種方式為皮下接種。接種24 h后，將小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為模型組(生理鹽水0.02 mL·g-1)、陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺，30 mg·kg-1·d-1)、BAE低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、中劑量組(100 mg·kg-1·d-1)、高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)、聯(lián)合治療組(BAE 200 mg·kg-1·d-1+環(huán)磷酰胺組30 mg·kg-1·d-1)。各組小鼠均為灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥10 d。

2.2.2抑瘤率和脾臟指數(shù)的測(cè)定小鼠建模、分組及給藥方式與2.2.1項(xiàng)下方法相同。停藥24 h后，稱取小鼠質(zhì)量，處死，并小心剝離瘤組織，分離脾臟，分別稱取質(zhì)量，并計(jì)算脾臟指數(shù)[7-8]。抑瘤率=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%；脾臟指數(shù)(mg·g-1)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.2.3小鼠存活期與生命延長(zhǎng)率的測(cè)定小鼠存活期自小鼠接種腫瘤之日開(kāi)始，到給藥組小鼠全部死亡為止，并記錄各組小鼠死亡時(shí)間，計(jì)算小鼠生命延長(zhǎng)率。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命延長(zhǎng)率=(給藥組平均生存時(shí)間-空白組平均生存時(shí)間)/空白組平均生存時(shí)間×100%。

2.3蕪菁水提物對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響(MTT法)解剖小鼠，小心剝離小鼠脾臟，研磨并加入RPMI-1640培養(yǎng)液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，離心，稀釋后制成1×107個(gè)·mL-1單細(xì)胞懸液。在超凈工作臺(tái)上，將脾細(xì)胞懸液分別加入96孔板中，每孔100 μL，并設(shè)置平行孔。按以下要求加樣：(1)實(shí)驗(yàn)組(ConA)：100 μL脾細(xì)胞懸液+50 μL不同質(zhì)量濃度BAE溶液+50 μL ConA溶液(5 μg· mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。對(duì)照組：100 μL脾細(xì)胞懸液+50 μL ConA溶液(5 μg·mL-1)+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。觀察T細(xì)胞增殖反應(yīng)。(2)實(shí)驗(yàn)組(LPS)：100 μL脾細(xì)胞懸液+50 μL不同質(zhì)量濃度BAE溶液+50 μL LPS溶液(5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。對(duì)照組：100 μL脾細(xì)胞懸液+50 μL LPS溶液(5 μg·mL-1)+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。觀察B細(xì)胞增殖反應(yīng)。BAE質(zhì)量濃度分別為0.01，0.05，0.25，0.5，0.75和1 mg·mL-1。在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄上清液，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1的噻唑藍(lán)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲亞砜150 μL，靜置30 min，用振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A570值。

3結(jié)果

3.1荷瘤小鼠抑瘤率和脾臟指數(shù)除模型組外，其他各組小鼠瘤質(zhì)量均減小，腫瘤均被明顯抑制，并且在BAE各劑量組中抑瘤效果與劑量呈正相關(guān)。BAE各劑量組小鼠脾臟指數(shù)較模型組顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CTX組脾臟指數(shù)小于模型組，可能由于CTX作為一種化療藥物，具有較強(qiáng)的免疫抑制功能，對(duì)小鼠脾臟有嚴(yán)重的毒性和不良反應(yīng)，抑制脾臟生長(zhǎng)。聯(lián)合治療組脾臟指數(shù)大于CTX組，但小于BAE各劑量組，說(shuō)明多糖在改善荷瘤小鼠免疫功能的同時(shí)，可以降低CTX對(duì)脾臟造成的損傷。見(jiàn)表1。

表16組荷瘤小鼠腫瘤抑制率及脾臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果

Tab.1 The effect of BAE on tumor inhibition ratio and spleen index in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s)

注：**P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2荷瘤小鼠存活時(shí)間及生命延長(zhǎng)率給藥組小鼠生存時(shí)間增加，與模型組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。BAE各劑量組小鼠生存時(shí)間低于CTX組。聯(lián)合治療組小鼠生存時(shí)間最長(zhǎng)，生命延長(zhǎng)率達(dá)到78.1 %。見(jiàn)表2。

3.3荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞功能當(dāng)BAE質(zhì)量濃度為0.5，0.75和1 mg·mL-1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(加ConA)A值與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，初步說(shuō)明其可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖。當(dāng)BAE質(zhì)量濃度為0.25，0.5，0.75和1 mg·mL-1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(加LPS)A值與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，初步說(shuō)明可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖。見(jiàn)表3。

表26組荷瘤小鼠存活時(shí)間及生命延長(zhǎng)率測(cè)定結(jié)果

Tab.2 The effect of BAE on survival times and extension ratio of life span in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s， n=12)

表36組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能測(cè)定結(jié)果

Tab.3 The effect of BAE on splenic lymphocyte transformation in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s， n=12)

注：**P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4討論

本實(shí)驗(yàn)采用了Lewis移植性腫瘤模型進(jìn)行了BAE體內(nèi)抗腫瘤的初步研究。BAE與環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療組小鼠腫瘤被明顯抑制，瘤質(zhì)量減小，抑瘤效果很好，生命延長(zhǎng)率增加，并且脾臟指數(shù)較陽(yáng)性對(duì)照組有較明顯的增加，說(shuō)明BAE能明顯地改善環(huán)磷酰胺造成的免疫低下，同時(shí)，對(duì)荷瘤小鼠的免疫器官有一定的保護(hù)作用。提示BAE可以作為環(huán)磷酰胺的輔助藥物，減輕傳統(tǒng)化學(xué)藥物的不良反應(yīng)，減輕患者的痛苦，一定程度延長(zhǎng)其生命。另外，BAE與環(huán)磷酰胺的作用機(jī)制不盡相同，環(huán)磷酰胺有免疫抑制作用，所以BAE不能與環(huán)磷酰胺同時(shí)給藥。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩者的給藥時(shí)間間隔初步設(shè)定為3 h。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，主要功能是參與免疫反應(yīng)，并且含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。脾細(xì)胞增殖是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞受到抗原物質(zhì)刺激后能分裂增殖、發(fā)生特異性免疫應(yīng)答、產(chǎn)生抗體或淋巴因子。用藥物刺激淋巴細(xì)胞的增殖，檢測(cè)藥物對(duì)T、B細(xì)胞功能的影響是探討藥物抗腫瘤作用機(jī)制和篩選其活性強(qiáng)弱的首要方法。本研

究結(jié)果顯示，與模型組相比，BAE各劑量組均能夠抑制荷瘤小鼠腫瘤，而B(niǎo)AE在0.5～1 mg·mL-1的范圍內(nèi)，可以同時(shí)誘導(dǎo)T、B細(xì)胞增殖，說(shuō)明BAE有脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，進(jìn)而具有抗腫瘤活性。提示BAE抗腫瘤作用機(jī)制之一是通過(guò)活化T、B淋巴細(xì)胞增強(qiáng)而發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)蕪菁水提物抗腫瘤活性的初步研究，水提物具體組成未知，僅在本課題組之前的研究中發(fā)現(xiàn)，水提物中總多糖含量超過(guò)10%，其余組分有待進(jìn)一步研究其起效成分和作用機(jī)制，擬通過(guò)分離純化確定其中主要作用的1種或幾種成分。

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Study on the anti-tumor effect of aqueous extract fromBrassicarapaL.

CHEN Zhuoer1， Gunana DUISHANBIEKE2， WU Ying3， HOU Baolin1*， Hailiqian TAOERDAHONG1*

(1. College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China； 2. Department of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University ，Urumqi 830000， China； 3. Department of Pharmacy， the People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000， China)

Abstract:ObjectiveTo explore the inhibitory action of aqueous extract from Brassica rapa L.(BAE) on the transplantable cancer mice.MethodsThe anti-tumor effects of BAE were tested in mice with transplanted tumorsarcom Lewis. The tumor inhibition rate， life span， spleen index and the lymphocyte transformation function in vitro were evaluated. ResultsThe tumor weight of BAE groups showed statistical significance compared with that of NS group (P<0.01)， the spleen index of BAE groups had statistical significance compared with that of NS group (P<0.05)， and survival days of polysaccharides groups demonstrated statistical significance compared with that of NS group (P<0.01). Furthermore， it was shown that lymphocyte transformation function in vitro could be enhanced by BAE.ConclusionThe tumor inhibitory rate， the spleen index and life prolonging rate could be increased by BAE. In addition， the preliminary results show that lymphocyte transformation function in vitro could be enhanced by BAE.

Key words:Brassica rapa L.；aqueous extracts； anti-tumor

(收稿日期：2015-10-10)

中圖分類號(hào)：R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0264-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.013

作者簡(jiǎn)介：陳卓爾，女，碩士研究生

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81460615)；新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題項(xiàng)目(編號(hào)：XJDX0208-2012)

*共同通信作者：侯寶林，男，碩士研究生

海力茜·陶爾大洪，女，教授