不同前處理方法提取牙齒DNA的比較

駱繼懷，孫紅兵，楊　鑫，張子龍，王　濤（1.蘭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，甘肅蘭州7000；.甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州70070；.甘肅省公安廳，甘肅蘭州7000）

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不同前處理方法提取牙齒DNA的比較

駱繼懷1，2，孫紅兵1，2，楊鑫1，2，張子龍2，王濤3
（1.蘭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，甘肅蘭州730030；2.甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；3.甘肅省公安廳，甘肅蘭州730030）

摘要：目的對(duì)三種不同前處理方法提取的牙齒DNA濃度進(jìn)行比較，建立一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)適用、濃度較高的牙齒DNA提取的前處理方法。方法選擇源自7具尸體的共21顆磨牙，每具尸體的3顆磨牙隨機(jī)按牙屑法、球磨法、液氮研磨法進(jìn)行前處理，并分別稱取50mg，采用AutoMate ExpressTM法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取DNA，對(duì)三種方法提取的DNA濃度和STR分型結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果牙屑法、球磨法和液氮研磨法提取的DNA質(zhì)量濃度分別為0.0556～1.989 1、0.036 6～1.1756和0.037 8～1.249 0 ng/μL，牙屑法提取的DNA質(zhì)量濃度較高（P<0.05），且STR分型成功率高。結(jié)論牙屑法結(jié)合AutoMate ExpressTM法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)是提取牙齒DNA的一種切實(shí)可行的方法，可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA；牙；提取法；前處理

白骨化生物檢材的法醫(yī)身份識(shí)別中，由于檢材本身所含DNA量少，并且高度降解，給DNA的提取帶來一定難度。牙齒相對(duì)于骨骼等其他陳舊性生物檢材，因其自身的一些優(yōu)勢，成為陳舊性生物檢材DNA檢驗(yàn)的首選生物檢材之一。近年來，牙齒、骨骼的DNA檢驗(yàn)在提取方法上不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，STR分型檢驗(yàn)成功率不斷提高［1－4］。本研究針對(duì)牙齒DNA提取中三種不同前處理方法進(jìn)行比較，以建立一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的提取牙齒DNA的前處理方法。

1　材料與方法

1.1樣本來源

選取21顆源自7具尸體（編號(hào)為A、B、C、D、E、F、G）的磨牙，每具尸體3顆，均來自本實(shí)驗(yàn)室案件積累。

1.2樣本前處理

用手術(shù)刀片刮凈牙齒表面，用1%H2O2浸泡10min，紫外燈照射。將每具尸體的3顆磨牙隨機(jī)按以下三種方法進(jìn)行處理：（1）牙屑法，手術(shù)刀片切取根尖部的牙屑50mg，分別用75%乙醇溶液和無水乙醚浸泡10min，以離心半徑5cm，13000 r/min，離心5min，棄去上清液，風(fēng)干備用；（2）球磨法，將磨牙（除牙冠外）用TissueLyserⅡ球磨機(jī)（德國QIAGEN公司）研磨成粉，稱取50mg備用；（3）液氮研磨法，將磨牙（除牙冠外）用TissueLyser－Ⅱ高通量組織研磨儀（美國SPEX?SamplePrep公司）研磨成粉，稱取50mg備用。

1.3DNA提取

將PreFiler Express BTATM法醫(yī)DNA提取試劑盒（美國AB公司）中的裂解液220μL、蛋白酶K 6.5μL、3.5μL 1mol/L DTT（新鮮配制）分別加入前處理好的牙齒樣本中，56℃恒溫混勻儀孵育過夜，以離心半徑5 cm，10 000 r/min，離心2min，上清液用AutoMate ExpressTM法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)（美國AB公司）提取DNA，模板DNA洗脫體積50μL。

1.4DNA定量及STR分型

用7500型熒光定量PCR儀（美國AB公司）定量牙齒的DNA濃度，反應(yīng)條件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，定量結(jié)果用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。

用Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25μL，反應(yīng)條件：95℃11min；94℃20 s，59℃3min，30個(gè)循環(huán)；60℃10min，10℃保存。PCR產(chǎn)物在3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司）上進(jìn)行電泳，利用GeneMapper v3.2分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)　果

采用上述三種方法對(duì)牙齒進(jìn)行前處理后，牙屑法提取的DNA質(zhì)量濃度為0.055 6～1.989 1 ng/μL，球磨法為0.036 6～1.175 6ng/μL，液氮研磨法為0.0378～1.2490ng/μL。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，牙屑法濃度較高，分型結(jié)果較好（表1）。

表1　三種前處理方法提取的DNA濃度及基因座檢出數(shù)?。╪=3，±s，ng/μL）

表1　三種前處理方法提取的DNA濃度及基因座檢出數(shù)　（n=3，±s，ng/μL）

注：1）與牙屑法比較，P＜0.05

編號(hào)　牙屑法　球磨法　液氮研磨法質(zhì)量濃度　基因座數(shù)/個(gè)　質(zhì)量濃度　基因座數(shù)/個(gè)　質(zhì)量濃度　基因座數(shù)/個(gè)A　0.0885±0.0351　15　0.0521±0.01211）　13　0.0562±0.01361）　14 B　0.0556±0.0135　15　0.0366±0.01121）　8　0.0378±0.01231）　9 C　1.9891±0.0164　15　1.1756±0.01341）　15　1.2490±0.01471）　15 D　0.7680±0.0421　15　0.4765±0.02351）　15　0.4881±0.02111）　15 E　1.4670±0.0976　15　0.9696±0.07461）　15　0.9786±0.07581）　15 F　0.9786±0.0521　15　0.7452±0.03221）　15　0.7675±0.03181）　15 G　0.0664±0.0121　15　0.0492±0.01461）　11　0.0523±0.02011）　12

3　討　論

法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中，白骨化樣本的個(gè)人識(shí)別屬于難度較大的一類。牙齒因其保存環(huán)境較好、抑制物少、檢出率高、易于從尸骨中獲取以及便于清潔、保存、送檢等原因已作為陳舊性生物檢材DNA檢驗(yàn)的首選生物檢材之一。目前，最常用的牙齒DNA檢驗(yàn)前處理方法為液氮研磨法，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于低溫環(huán)境使模板DNA穩(wěn)定；其次為球磨法，該方法雖然在設(shè)備要求和使用消耗上比液氮研磨法簡便，但是對(duì)牙齒自身的物理性狀要求很高，如要求牙齒水分較少時(shí)才能破碎，否則牙粉很容易黏附在破碎容器壁上，造成檢驗(yàn)用量的損失［1］。上述兩種前處理方法雖然常用，但限制條件較多，且都需要配備專用牙齒破碎設(shè)備才能完成。牙屑法在牙齒DNA提取前處理方法上進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合AutoMate ExpressTM法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)的優(yōu)勢，使牙齒DNA檢驗(yàn)方法獲得了整體優(yōu)化，不僅在操作過程中避免了液氮研磨法操作的危險(xiǎn)性和球磨法必須牙齒干燥等物理?xiàng)l件的限制［1，4－6］，關(guān)鍵是牙屑法簡化了牙齒前處理操作步驟，同時(shí)顯著提高了STR分型成功率，降低了檢驗(yàn)成本。

牙屑法相對(duì)球磨法和液氮研磨法所獲得的DNA濃度明顯提高的原因可能是：（1）對(duì)牙齒來說，靠近牙根部位牙骨質(zhì)中有核細(xì)胞豐富，提取的DNA濃度會(huì)相對(duì)提高；（2）球磨法和液氮研磨法是將牙頸和牙根同時(shí)破碎混合，牙粉中有核細(xì)胞量相對(duì)牙屑法減少，同時(shí)牙粉中鈣等PCR抑制物含量增加；（3）牙屑法獲取牙屑過程中DNA損失較小。

在牙齒DNA檢驗(yàn)過程中，一般推薦牙粉的使用量在100mg以上［1，7］，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際案件檢驗(yàn)分析顯示，在牙齒前處理后裂解用量較少的條件下，采用牙屑法能在簡化檢驗(yàn)操作的同時(shí)，顯著提高牙齒DNA分型檢驗(yàn)的成功率，實(shí)驗(yàn)中各尸體提取的DNA濃度范圍較大，推斷原因可能是不同個(gè)體之間的牙齒差異所致。牙屑法50mg的量足以檢驗(yàn)出完整STR分型，使牙齒檢驗(yàn)所需量減少一半。

綜上所述，采用牙屑法操作簡單，可以顯著提高牙齒DNA濃度及STR分型成功率。因此牙屑法結(jié)合AutoMate ExpressTM法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)可用于白骨化尸體的身份識(shí)別鑒定實(shí)踐。

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（本文編輯：李成濤）

·綜述·

Com parison of Different Pretreatment Methods for DNA Extraction from Teeth

LUO Ji－h(huán)uai1，2，SUN Hong－bing1，2，YANG Xin1，2，ZHANG Zi－long2，WANG Tao3
（1.Institute of Criminal Science and Technology，Lanzhou Public Security Bureau，Lanzhou 730030，China；2.Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application of Gansu Province，Lanzhou 730070，China；3.Gansu Provincial Public Security Department，Lanzhou 730030，China）

Abstract：Objective To compare the concentration of teeth DNA extracted by three different pretreatment methods and to explore a simple，economical and practical pretreatment method w ith high concentration of extracted DNA from teeth.M ethods A total number of 21 molars were collected from 7 corpses. The pretreatment of 3 molars from each individual was random ly performed by tooth crumb method，ball－m illing method and liquid nitrogen m illing method and 50mg tooth crumb was weight and DNA was extracted by AutoMate ExpressTMforensic DNA extraction system.Subsequently，the concentration of DNA and corresponding STR genotyping of threemethodswere compared.Results The DNA concentration extracted by tooth crumb method，ball－milling method and liquid nitrogen milling method was 0.055 6－1.9891 ng/μL，0.0366－1.1756ng/μL and 0.0378－1.2490 ng/μL，respectively.The DNA concentration obtained by tooth crumb method was higher（P＜0.05）and the success rate of STR genotyping was high. Conclusion Combined w ith AutoMate ExpressTMforensic DNA extraction system，tooth crumb method is an efficient and feasiblemethod to extract DNA from teeth，which can be applied in forensic practice.

Key words：forensic genetics；DNA；tooth；extraction；pretreatment

收稿日期：（2015－02－11）

通信作者：孫紅兵，男，主任法醫(yī)師，教授，主要從事法醫(yī)損傷學(xué)、法醫(yī)物證學(xué)研究；E－mail：sunhb.good＠163.com

作者簡介：駱繼懷（1983—），男，碩士研究生，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證鑒定及法醫(yī)分子生物學(xué)研究；E－mail：lanzhou DNA110＠126.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81302622）；甘肅省青年科技基金計(jì)劃資助項(xiàng)目（1308RJYA059）；甘肅省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（145RJZA038）；甘肅省公安廳技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2016JSYJ01）

文章編號(hào)：1004－5619（2016）02－0123－03

中圖分類號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.011