六色熒光標(biāo)記快速PCR擴增體系的建立及驗證

劉亞舉，張俊濤，金海英，石美森（.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南許昌6000；.襄城縣公安局刑偵大隊，河南襄城6700；.寧波海爾施基因科技有限公司，浙江寧波5000；.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室，北京00088）

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六色熒光標(biāo)記快速PCR擴增體系的建立及驗證

劉亞舉1，張俊濤2，金海英3，石美森4
（1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南許昌461000；2.襄城縣公安局刑偵大隊，河南襄城461700；3.寧波海爾施基因科技有限公司，浙江寧波315000；4.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室，北京100088）

摘要：目的建立PCR快速擴增程序和體系，并對其技術(shù)指標(biāo)進行驗證。方法采用六色熒光標(biāo)記技術(shù)，對24個常染色體STR基因座、1個Y－STR基因座和Amelogenin、Y－InDel基因座進行復(fù)合擴增及毛細管電泳檢測，同時考察體系的靈敏度、特異性、同一性、穩(wěn)定性、混合樣本及批量樣本測試，并觀察各種常見檢材及降解、脫落細胞檢材的分型情況。結(jié)果所建立的體系靈敏度達0.0625ng，快速擴增僅耗時65min就可獲得準(zhǔn)確分型；種屬特異性高；各種紙質(zhì)血樣本和混合、降解、脫落細胞檢材的分型正確。結(jié)論本研究建立的快速擴增體系可顯著提升檢驗速率，分型準(zhǔn)確、穩(wěn)定，對建立STR數(shù)據(jù)庫、研究群體遺傳學(xué)和進行法醫(yī)學(xué)鑒定有重要意義。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；短串聯(lián)重復(fù)序列；快速PCR；復(fù)合STR擴增試劑

STR分型是目前法醫(yī)學(xué)檢驗中DNA分型技術(shù)的核心，而PCR擴增反應(yīng)是DNA檢驗中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常規(guī)PCR擴增過程需要約3 h，如果能進一步縮短，將有利于提高鑒定效率?？焖貾CR擴增在保證各項性能指標(biāo)的前提下，能實現(xiàn)較短時間內(nèi)高效擴增目的片段［1］，現(xiàn)有商品化的GlobalFilerTMExpress試劑盒（美國AB公司）［2］使用六色熒光標(biāo)記技術(shù)，且提高了STR檢測數(shù)量。本研究采用快速PCR擴增和六色熒光標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建一個新的復(fù)合擴增檢測體系，包含24個常染色體STR基因座、1個Y－STR基因座和Amelogenin、Y－InDel基因座，并對其性能指標(biāo)和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進行評估。

1　材料與方法

1.1樣本

河南漢族數(shù)據(jù)庫無關(guān)個體血樣1 136份，其中血樣載體為FTA卡250份、定量濾紙250份、公安部物證鑒定中心研制的（公安）卡250份、武漢驥騰科技有限公司研制的（武漢）卡250份、其他紙質(zhì)136份；案件檢材200份，包括血痕、唾液斑、肌肉組織、肋軟骨、帶毛囊毛發(fā)、降解檢材、脫落細胞檢材。樣本均來源于日常檢案積累。實驗室用標(biāo)準(zhǔn)品DNA：9947A和007（美國AB公司）、9948（美國Promega公司）。

1.2DNA提取和定量

上述案件樣本采用磁珠法利用自動化工作站提取DNA［3］，使用BioSpectrometer D30核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）進行純度分析。

在epMotion P5073自動移液工作站（德國Eppendorf公司）構(gòu)建PCR定量加樣程序，使用Mastercycler? ep realplex定量PCR儀（德國Eppendorf公司）進行定量。

1.3復(fù)合擴增體系的建立

1.3.1引物設(shè)計及標(biāo)記

24個常染色體STR基因座、1個Y－STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座序列信息查自GDB數(shù)據(jù)庫［4］，相關(guān)信息見表1。

表1　24個常染色體STR基因座、1個Y－STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座的相關(guān)信息

1.3.2PCR擴增

PCR反應(yīng)總體積為10μL［5］，內(nèi)含DNA模板0.5～1ng和PCR Master Mix［1mol/L Tris－HCl（pH=8.0）、4 mol/L KCl、4 mol/L Betaine、1 mol/L Mg2SO4、10% Tween 20、dNTP、HS－Taq］5μL、4×Primer Mix［5］（含有熒光標(biāo)記和未標(biāo)記的引物等）2.5μL，其中PCR Master Mix和4×Primer Mix由寧波海爾施基因科技有限公司合成。在Master cycler pro S銀座熱循環(huán)儀（美國Eppendorf公司）上進行復(fù)合擴增，熱循環(huán)條件［5］：95℃5min；94℃5 s，61℃50 s，27～30個循環(huán)；60℃15min；4℃保溫。擴增用時65min（27個循環(huán)）～69min （30個循環(huán)）。其中血樣載體樣本27個循環(huán)，案件中的微量和降解檢材30個循環(huán)，其他案件中的普通檢材28個循環(huán)。

1.4電泳與分型

取1μL擴增產(chǎn)物與0.5μL內(nèi)標(biāo)SIZE－500（寧波海爾施基因科技有限公司）和8.5μL去離子甲酰胺混合，在3500XL型遺傳分析儀（美國AB公司）上進行毛細管電泳，Collection軟件收集數(shù)據(jù)，用GeneMarker? HID分析軟件（美國SoftGenetics公司）進行等位基因分型，并采用GeneMapper ID－X軟件復(fù)核分析。

1.5快速擴增體系技術(shù)指標(biāo)驗證

靈敏度檢測樣本：男性樣本標(biāo)準(zhǔn)品9948，用定量PCR方法進行定量后，分別以4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125ng的模板DNA進行擴增檢測，平行重復(fù)3次。

特異性檢測樣本：馬、狗、豬、牛、羊、貓、雞、鴨、鼠、兔、魚等動物DNA樣品（購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院），根據(jù)說明書稀釋到1.0ng/μL；大腸桿菌DNA樣品（購自中科院微生物研究所），根據(jù)說明書稀釋到1.0ng/μL。平行重復(fù)3次。

同一性檢測樣本：60例同一男性個體血痕、唾液斑、肌肉組織、肋軟骨、帶毛囊毛發(fā)，經(jīng)DNA提取與定量后，采用本研究方法檢測，與采用GlobalFilerTMExpress試劑盒進行分型檢驗的結(jié)果進行比對。

穩(wěn)定性檢測樣本：在0.5ng男性標(biāo)準(zhǔn)品9948中加入不同抑制物，血紅素80、120、160、200、300μmol/L；EDTA 0.6、0.8、1.0μmol/L；腐殖酸5、10、20 ng/μL；鈣離子1.0、1.5、1.75mmol/L。平行重復(fù)3次。

男男混合樣本：將質(zhì)量濃度為1.0 ng/μL男性標(biāo)準(zhǔn)品9948和007按V（9948）:V（007）=19:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、2:3、3:7、1:4、1:9、1:19進行混合。平行重復(fù)3次。

男女混合樣本：將質(zhì)量濃度為1.0ng/μL男性標(biāo)準(zhǔn)品9948和女性標(biāo)準(zhǔn)品9947A按V（9948）:V（9947A）= 19:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、2:3、3:7、1:4、1:9、1:19進行混合。平行重復(fù)3次。

案件適用性檢測樣本：降解檢材70份、脫落細胞檢材70份，經(jīng)DNA提取與定量后，采用本研究方法檢測，與采用GlobalFilerTMExpress試劑盒進行分型檢驗的結(jié)果進行比對。

遺傳多態(tài)性調(diào)查樣本：河南漢族數(shù)據(jù)庫無關(guān)個體血樣1136份，按直徑1.0mm取樣進行直接擴增［5］。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用本研究快速擴增體系擴增，所得STR檢測圖譜均與已知分型結(jié)果比對，以獲得20個以上常染色體STR基因座分型正確且各等位基因峰高大于50RFU為有效分型；每個條件下的重復(fù)實驗結(jié)果按照同一基因座出現(xiàn)該峰兩次以上的原則進行綜合分析。

分型效果分析指標(biāo)包括：檢出率（有效分型次數(shù)/重復(fù)次數(shù)）、非特異性擴增率（出現(xiàn)非特異性擴增的基因座數(shù)/24個基因座×重復(fù)次數(shù)）、等位基因丟失率（等位基因丟失條帶總數(shù)/預(yù)計等位基因總條帶數(shù)）［6］。

2　結(jié)　果

2.1方法準(zhǔn)確性及峰值均衡性

本研究構(gòu)建的復(fù)合擴增體系中等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物分型均在規(guī)定范圍內(nèi)，圖譜清晰，各等位基因峰高均大于200RFU；各基因座相鄰的兩個等位基因片段差均在預(yù)期范圍內(nèi)；相鄰基因座間無等位基因分型重疊；等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和陽性對照DNA沒有產(chǎn)生錯誤分型；在等位基因范圍內(nèi)出現(xiàn)的非等位基因峰均低于相鄰等位基因峰高的20%。雜合子兩峰高的比例均大于70%，同一熒光標(biāo)記物不同基因座之間的峰高比例大于50%，不同熒光標(biāo)記物間的峰高比例大于30%，峰值均衡（圖1）。

圖1　等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)分型圖譜

該快速擴增體系用時65min，男性樣本在Y-InDel 和DYS391基因座上有分型出現(xiàn)（圖2），而女性樣本則沒有（圖3）。

圖2　男性血樣經(jīng)快速PCR擴增后的分型圖譜

圖3　女性血樣經(jīng)快速PCR擴增后的分型圖譜

2.2靈敏度

本研究方法最佳模板量在0.125～2ng；模板量低至0.0625ng也可獲得完整STR分型，且峰值在合理的范圍內(nèi)，但檢出率為98.65%、等位基因丟失率達10.22%（表2）；模板量大于2 ng時，仍可獲得較好的分型結(jié)果，但出現(xiàn)拔起峰、滲透峰等雜峰。

表2　靈敏度驗證的檢測結(jié)果?。?）

2.3特異性、同一性及穩(wěn)定性

種屬特異性：采用本研究體系對馬、狗、豬、牛、羊、貓、雞、鴨、鼠、兔、魚和大腸桿菌樣本進行檢測，結(jié)果均未檢見特異分型。

同一性：采用本研究體系檢測同一男性個體血痕、唾液斑、肌肉組織、肋軟骨、帶毛囊毛發(fā)樣本（DNA純度為2.1，質(zhì)量濃度為0.15 ng/μL），結(jié)果均獲得相同分型，與GlobalFilerTMExpress試劑盒分型一致。

穩(wěn)定性：采用本研究體系對加入不同抑制物的0.5ng標(biāo)準(zhǔn)品9948進行檢測，結(jié)果均未出現(xiàn)基因座丟失現(xiàn)象，且各濃度擴增結(jié)果無差異。

2.4混合樣本

標(biāo)準(zhǔn)品9948分別和007、9947A按11種比例混合，檢測結(jié)果顯示，比例為19:1和1:19時出現(xiàn)嚴重的等位基因丟失現(xiàn)象，但V（9948）:V（9947A）=1:19時Y-InDel和DYS391基因座的峰高仍與9947A分型的峰高相近；而比例為18:2和2:18時也出現(xiàn)部分基因座的等位基因丟失，但結(jié)果可以判讀；其他比例混合時，各基因座均能得到清晰準(zhǔn)確的分型，且峰的均衡性比例較為明顯（圖4），說明本研究所建體系對混合樣本的個人識別具有一定意義。

圖4　男女混合樣本分型圖譜［V（9948）:V（9947A）=3:7］

2.5常見載體及實際案例檢材

采用本研究體系檢測幾種紙質(zhì)血卡樣本，結(jié)果均獲得完整分型。對實際案例脫落細胞檢材和降解檢材（DNA純度為2.1，質(zhì)量濃度為0.15ng/μL）各70份進行分型檢測，結(jié)果表明所有分型與GlobalFilerTMExpress試劑盒分型一致，而GlobalFilerTMExpress試劑盒的靈敏度為0.062 5～1 ng［7］，說明本研究的復(fù)合擴增體系能夠用于法醫(yī)學(xué)實踐中微量、降解檢材的DNA檢驗。

2.6遺傳多態(tài)性調(diào)查

1136例河南漢族無關(guān)個體血樣經(jīng)本方法檢測，結(jié)果與GlobalFilerTMExpress試劑盒［2］相同基因座的分型結(jié)果均完全一致，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性和一致性。

在1136名河南漢族無關(guān)個體中，24個常染色體STR基因座［2，8］共檢出347個等位基因、1 438種基因型。各等位基因的分布頻率在0.0004～0.5260，所檢測的24個常染色體STR基因座的H為0.630 3～0.9357，Pm為0.0070～0.1960，DP為0.804 0～0.9930，PEduo為0.214 6～0.793 0，PEtrio為0.369 8～0.884 6，PIC 為0.567 7～0.940 4；SE33基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)（Pm除外）均為最高。累積個人識別率為1－4.879 3× 10－30，二聯(lián)體累積非父排除率為1－2.3005×10－7，三聯(lián)體累積非父排除率為1－2.3652×10－11。綜上所述，本研究的D1S1656等24個常染色體STR基因座在河南漢族人群中具有良好的遺傳多態(tài)性，適用于法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定和個人識別。

3　討　論

本研究通過利用優(yōu)化了的PCR Master混合物，增強緩沖液系統(tǒng)抗抑制效應(yīng)，建立了適合法醫(yī)DNA檢驗的快速擴增體系和程序，可在較短的65min（27個循環(huán)）～69min（30個循環(huán)）內(nèi)完成擴增，其中所使用的快速擴增儀的升、降溫速率分別為6℃/s和4.5℃/s。另外在常染色體和性別基因座的基礎(chǔ)上增加了Y-Indel 和DYS391可以輔助判斷被檢驗樣本性別，有利于提高快速檢驗時的識別能力。

為了便于國際DNA數(shù)據(jù)交換和共享，原CODIS系統(tǒng)的13個基因座和歐洲標(biāo)準(zhǔn)（ESS）的常用基因座被聯(lián)合使用［9］，原有的五色熒光標(biāo)記技術(shù)（5－dyeTM）不能滿足需求，利用突破性的六色熒光6－dyeTM技術(shù)，更多數(shù)量的STR基因座可以形成單一復(fù)合擴增體系。本研究構(gòu)建的六色熒光標(biāo)記快速PCR擴增體系增加了中國DNA數(shù)據(jù)庫中廣泛采用的基因座D6S1043、Penta E和Penta D，總共27個基因座，不僅解決了與數(shù)據(jù)庫中共用基因座共享的數(shù)量問題［10］，而且縮短了擴增時間，促進了DNA數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用效能和發(fā)展前景。本研究遺傳多態(tài)性調(diào)查結(jié)果顯示，SE33基因座在中國人群中的各項群體遺傳學(xué)參數(shù)（Pm除外）均為最高，檢出45個等位基因、273種基因型，但由于其內(nèi)部序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜［9，11－12］，雖然ESS將其作為建立DNA數(shù)據(jù)庫的核心基因座，但在中國人群仍存在大量等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物范圍外（off－ladder，OL）的等位基因［2，13－21］，因此需要克隆符合中國人群的Ladder，使其含有充足的標(biāo)準(zhǔn)等位基因，同時擴展panel、增加虛擬bin，以增強等位基因的自動化判讀，減少OL的發(fā)生。

綜上，本研究建立的六色熒光標(biāo)記快速復(fù)合擴增體系（24個常染色體STR基因座、1個Y－STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座），各項性能技術(shù)指標(biāo)均符合法醫(yī)DNA檢驗的需要，與其他方法相比具有較大的兼容性和較高的個人識別能力，在案件檢驗和數(shù)據(jù)庫建設(shè)等方面有良好的應(yīng)用前景。

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（本文編輯：柳燕）

Establishment and Verification of 6-color Fluorescent-labeled Rapid PCR Amplification System

LIU Ya－ju1，ZHANG Jun－tao2，JIN Hai－ying3，SHI Mei－sen4
（1.Institute of Criminal Science and Technology，Xuchang Public Security Bureau，Xuchang 461000，China；2.Criminal Investigation Team，Xiangcheng Public Security Bureau，Xiangcheng 461700，China；3.HEALTH Gene Technologies Incorporation，Ningbo 315000，China；4.Key Laboratory of Evidence Science，Ministry of Education，China University of Political Science and Law，Beijing 100088，China）

Abstract：Objective To establish the rapid PCR amplification program and system and to verify the technical indexes.M ethods PCR multiplex and capillary electrophoresis detection of 24 autosomal STR loci and one Y－STR loci using the 6－color fluorescence marking technology，as well as Amelogenin and Y－InDel.Meanwhile，sensitivity，specificity，identity，stability，m ixing and a batch of sample tests were investigated，and the genotype of various routine samples and degraded，exfoliated cell sampleswere observed. Results The sensitivity of the system was 0.062 5ng.In addition，the genotype could be detected accurately only around 65min via rapid amplification.The species－specificity was high and the genotyping of all kinds of dry blood specimens of filter paper and mixed，degraded，exfoliated cell samples were accurate.Conclusion The rapid amplification system can significantly improve the detection rate，and obtain accurate and stable genotyping results，which may be important implications for the establishment of STR database and study on population genetics and forensic identification.

Key words：forensic genetics；short tandem repeat；rapid PCR；multiplex STR detection

收稿日期：（2015－08－31）

通信作者：石美森，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)和群體遺傳學(xué)研究；E－mail：shimeisen2000＠163.com

作者簡介：劉亞舉（1978—），男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗和群體遺傳學(xué)研究；E－mail：horse3697＠126.com

文章編號：1004－5619（2016）02－0109－05

中圖分類號：DF795.2

文獻標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.008