STR基因座與Amelogenin的峰面積比在DNA降解評估中的應(yīng)用

解雅玲，李　璐，邵誠臣，吳軼慧，杜鐵帥，周懷谷，李　輝，謝建輝，沈憶文（.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，上海000；.上海市公安局靜安分局，上海00040；.上海市公安局物證鑒定中心法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實驗室上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實驗室，上海0008）

?

STR基因座與Amelogenin的峰面積比在DNA降解評估中的應(yīng)用

解雅玲1，李璐2，邵誠臣1，吳軼慧1，杜鐵帥1，周懷谷3，李輝3，謝建輝1，沈憶文1
（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，上海200032；2.上海市公安局靜安分局，上海200040；3.上海市公安局物證鑒定中心法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實驗室上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實驗室，上海200083）

摘要：目的研究DNA降解過程中STR基因座與性別基因座Amelogenin（AMEL）峰面積比（STR/AMEL）的變化規(guī)律，探討STR/AMEL值在評估DNA降解程度中的應(yīng)用。方法取人體髂腰肌組織抽提DNA，分析DNaseⅠ酶人工降解后STR/AMEL值（Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL）的變化，并分析室外環(huán)境自然降解的髂腰肌組織中三者比值的變化。以降解時間為自變量（x），STR/AMEL值為因變量（y），進(jìn)行回歸曲線分析，建立兩種條件下三組曲線方程。結(jié)果人工降解及自然降解條件下STR/AMEL值與降解時間均呈負(fù)相關(guān)，一元三次方程能夠較好地模擬STR/AMEL值隨降解時間的變化規(guī)律。人工降解條件下，R2均大于0.99；自然降解條件下，R2均大于0.86。結(jié)論STR/AMEL值（Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL）與DNA降解程度呈負(fù)相關(guān)，有望應(yīng)用于DNA降解程度的評估。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA降解，壞死；短串聯(lián)重復(fù)序列；峰面積

從理論上來說，DNA離體時間越長或機(jī)體死后時間越長，DNA片段的降解程度就越高。相比短的DNA片段，長片段擁有更多的磷脂鍵，被外界因素破壞的機(jī)會更大。因此，檢測短片段DNA和長片段DNA的相對含量是評估DNA降解程度的重要手段。對DNA降解程度進(jìn)行分析，目前主要有定量PCR （q－PCR）法、定量模板擴(kuò)增技術(shù)（quantitative template amplification technology，Q－TAT）［2－4］等。q－PCR法是擴(kuò)增兩個片段大小不同的DNA片段，通過小片段與大片段含量比值的變化反映DNA降解程度，能夠動態(tài)反映目的片段的變化。Q－TAT法為PCR后定量的方法，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，分離不同片段，利用熒光強(qiáng)度（用峰面積或者峰高表示）表示各位點(diǎn)含量。q－PCR法和Q－TAT法均通過基因組DNA進(jìn)行非個人識別的額外檢測，需要消耗部分生物檢材，同時增加了辦案人員的工作量和工作時間。

在STR分型中，Amelogenin－X和Amelogenin－Y的長度約100bp，屬于短片段DNA，片段長度在個體中是恒定的。對于體外提取的非降解DNA來說，不考慮小等位基因的優(yōu)勢擴(kuò)增，Penta E、Penta D、FGA與Amelogenin（AMEL）擴(kuò)增后產(chǎn)物含量的比值為1。隨著DNA降解程度的增加，Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL值理論上應(yīng)該逐漸降低。因此，在進(jìn)行個人識別的同時，通過STR峰面積與AMEL峰面積比（STR/AMEL）分析DNA降解程度，不僅能夠從基因組DNA中獲得更多的信息，也減少了辦案人員的工作量，縮短了工作時間。

本研究應(yīng)用與Q－TAT類似的方法，選擇了Power-Plex?21系統(tǒng)中片段最短的性別基因座AMEL和片段最長的Penta E、Penta D、FGA作為研究對象，應(yīng)用PowerPlex?21系統(tǒng)試劑盒檢測相應(yīng)基因座的熒光面積，計算STR/AMEL值，探討其與降解程度的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀、7500型實時熒光定量PCR儀、3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司），NanoDrop 1000分光光度計（美國Thermo公司）；脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ，美國SIGMA公司），Chelex－100、Power-Plex?21系統(tǒng)（美國Promega公司）。

1.2樣本

本研究的髂腰肌組織來源于復(fù)旦大學(xué)紅十字會遺體捐贈中心提供的男性尸體1具，死后當(dāng)天取材。

“互聯(lián)網(wǎng)+”也對傳統(tǒng)會計行業(yè)提出了新的職能要求。事實上，現(xiàn)在的許多會計從業(yè)人員還沒有意識到本身的工作職能已發(fā)生變化?；ヂ?lián)網(wǎng)改變了社會各個領(lǐng)域的思維導(dǎo)向和各個企業(yè)的經(jīng)營模式，為傳統(tǒng)的會計行業(yè)提供了新的發(fā)展方向。面對瞬息萬變的經(jīng)濟(jì)環(huán)境，信息和數(shù)據(jù)以傳統(tǒng)的方式已不足以去整理，企業(yè)需要從互聯(lián)網(wǎng)的背景考慮，調(diào)整工作人員的工作方向，利用新型的高科技技術(shù)來處理信息。

1.3人工降解樣本處理

酚－氯仿法提取新鮮髂腰肌組織DNA，用NanoDrop 1000分光光度計測量濃度，定量至（340±10）ng/μL。抽出10μL置于PCR管中，不作任何處理，作為未降解DNA對照（0min）。

在PCR管中加入50μL上述提取的（340±10）ng/μL DNA溶液，加入0.1U DNaseⅠ，混勻，于消化0.5、1、2、3、5min后分別抽取10μL，加入Stop Buffer使其終止反應(yīng)，70℃10min使DNaseⅠ不可逆失活。采用瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA降解程度。

同樣方法，重復(fù)提取6次。

1.4自然降解樣本處理

取髂腰肌組織約3mm×3mm×3mm置于微量離心管中，共60管，分為10組，每組6管。取1組作為第0天樣本，其余放于密封盒中置于室外，記錄每天最高氣溫（中午12：00）與最低氣溫（晚上21：00），此后每24h取1組置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

應(yīng)用Chelex－100法提取DNA。在每管中加入5%Chelex－100 200μL，37℃溫水浴3 h，95℃金屬浴5min。

1.5擴(kuò)增產(chǎn)物分析

應(yīng)用PowerPlex?21系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，按照說明書配制反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：96℃1min；94℃10 s，59℃1min，72℃30 s，30個循環(huán)；60℃20min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用3130xl型遺傳分析儀進(jìn)行STR分型。

1.6電泳檢測和數(shù)據(jù)分析

使用GeneMapper ID v3.2軟件分析數(shù)據(jù)，峰檢測閾值為150 RFU，計算擴(kuò)增產(chǎn)物峰面積，并計算Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL值，以降解時間為自變量（x），STR/AMEL值為因變量（y），進(jìn)行回歸曲線分析。

2　結(jié)　果

2.1人工降解DNA的評估

瓊脂糖電泳檢驗結(jié)果顯示，隨著DNaseⅠ酶作用時間延長，DNA降解程度增加，片段長度逐漸減小（圖1）。該結(jié)果也表明基因組DNA在人工降解過程中，其降解程度是可控的，DNaseⅠ酶能夠逐漸消化基因組DNA。

圖1　DNA人工降解后瓊脂糖電泳結(jié)果

Penta E、Penta D、FGA與AMEL基因座的峰面積比值見表1。

表1　DNaseⅠ酶處理不同時間后Penta E、Penta D、FGA與AMEL峰面積比值（n=6，±s）

表1　DNaseⅠ酶處理不同時間后Penta E、Penta D、FGA與AMEL峰面積比值（n=6，±s）

時間/min Penta E/AMEL Penta D/AMEL FGA/AMEL 0　0.973±0.075　0.381±0.044　2.161±0.372 0.5　0.748±0.080　0.265±0.038　1.698±0.321 1　0.409±0.092　0.149±0.025　1.291±0.298 2　0.104±0.021　0.047±0.009　0.742±0.256 3　0.041±0.009　0.017±0.004　0.395±0.125 5　0.013±0.006　0.000±0.000　0.184±0.039

隨著人工降解時間的延長，各基因座與AMEL的峰面積比值呈下降趨勢。建立STR/AMEL值隨DNaseⅠ酶處理時間變化的一元三次方程數(shù)學(xué)模型。

2.2自然降解DNA的評估

Penta E、Penta D、FGA與AMEL基因座的峰面積比值見表2。

表2　死后不同時間Penta E、Penta D、FGA與AMEL的峰面積比值（n=6，±s）

表2　死后不同時間Penta E、Penta D、FGA與AMEL的峰面積比值（n=6，±s）

注：死亡8 d后，Penta E、Penta D、FGA基因座均出現(xiàn)等位基因丟失，故將其值記為0

時間/d Penta E/AMEL Penta D/AMEL FGA/AMEL 0　0.880±0.190　0.513±0.362　2.324±0.546 1　0.573±0.261　0.231±0.082　1.720±0.372 2　0.421±0.271　0.195±0.088　1.247±0.237 3　0.360±0.189　0.168±0.084　1.122±0.378 4　0.233±0.170　0.129±0.068　0.689±0.475 5　0.221±0.065　0.136±0.062　0.831±0.370 6　0.510±0.300　0.248±0.183　1.087±0.571 7　0.158±0.263　0.070±0.120　0.656±0.866 8　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000 9　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000

隨著室外放置時間的延長，各基因座與AMEL的峰面積比值逐漸降低。建立自然降解條件下STR/AMEL值隨室外放置時間變化的一元三次方程數(shù)學(xué)模型。

3　討　論

目前在法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域，STR是進(jìn)行個人識別應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記，個人識別的同時進(jìn)行DNA降解程度的評估，能夠為辦案人員提供更多的信息。本研究在探討控制條件下人工降解DNA，觀察STR與AMEL峰面積比值變化與降解程度之間相關(guān)性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究自然環(huán)境下STR與AMEL峰面積比值隨放置時間的變化規(guī)律，以期能在進(jìn)行個人識別的同時，評估DNA降解程度。研究結(jié)果表明，STR/AMEL值與酶處理時間和室外放置時間均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。人工降解及自然降解條件下，一元三次方程能較好地模擬STR/AMEL值隨降解時間的變化規(guī)律。在人工降解條件下，R2均大于0.99；自然降解條件下，R2均大于0.86。

很多學(xué)者［5－6］利用q－PCR對目的片段DNA進(jìn)行相對定量，然而在一定程度上難以普遍應(yīng)用；其次，q－PCR技術(shù)定量也受很多因素影響，如樣本濃度、擴(kuò)增體系、擴(kuò)增片段大小等都會影響其擴(kuò)增效率，從而影響結(jié)果的可靠性；另外，運(yùn)用q－PCR進(jìn)行定量的過程，將會浪費(fèi)部分檢材，不適合微量檢材的鑒定。本研究中，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒和檢測程序，能夠減少不同實驗室之間的差異；同時，在個人識別的同時分析DNA降解程度，能夠節(jié)省生物檢材的用量。因此，應(yīng)用STR/AMEL值分析DNA降解程度具有一定的優(yōu)勢。

基因組DNA的提取方法也影響STR的分型。陳輝等［7－8］對有機(jī)法及Chelex－100法提取組織DNA效果進(jìn)行了比較，認(rèn)為Chelex－100法耗時短，提取的DNA量多；酚－氯仿法獲得的DNA純度高，但消化、抽提耗時長，且抽提過程易造成DNA損失。本研究中，人工降解組和自然降解組的DNA分別用不同方法提取，結(jié)果顯示，在起始時間點(diǎn)，采用酚－氯仿法或Chelex－100法，STR/AMEL值均在較高水平，但Chelex－100法提取中，STR/AMEL值低于用酚－氯仿法提取后STR/AMEL值，考慮與Chelex－100法提取后DNA的純度不高有關(guān)，影響DNA的準(zhǔn)確定量。

自然環(huán)境中DNA降解過程非常復(fù)雜，溫度、濕度、光照不同，DNA降解速率也大不相同。對比人工降解與自然降解STR/AMEL值隨處理時間及室外放置時間變化規(guī)律的方程，發(fā)現(xiàn)人工降解條件下，一元三次方程與STR/AMEL值隨降解時間的變化規(guī)律相關(guān)性更高，R2小于人工降解組，提示在自然環(huán)境下，DNA降解規(guī)律更復(fù)雜，受到溫度、濕度等因素的影響，僅用一元三次方程難以準(zhǔn)確預(yù)測STR/AMEL的變化規(guī)律。

運(yùn)用STR/AMEL值推斷DNA降解程度存在一個問題，即STR的長度多態(tài)性，不同個體的同一STR基因座長度可能不同，相同DNA降解程度下的STR/AMEL值可能表現(xiàn)出差異。因此，進(jìn)一步研究DNA降解過程中STR基因座各等位基因與AMEL的峰面積比值變化規(guī)律，能夠更準(zhǔn)確地評估DNA降解程度。

參考文獻(xiàn)：

［1］Zhou C，Byard RW.Factors and processes causing accelerated decomposition in human cadavers--An overview［J］.J Forensic Leg Med，2011，18（1）：6-9.

［2］Swango KL，Timken MD，Chong MD，et al.A quantitative PCR assay for the assessment of DNA degradation in forensic samples［J］.Forensic Sci Int，2006，158（1）：14-26.

［3］Kitayama T，F(xiàn)ujii K，Nakahara H，et al.Estimation of the detection rate in STR analysis by determining the DNA degradation ratio using quantitative PCR［J］. Leg Med（Tokyo），2013，15（1）：1-6.

［4］Smith BC，Vandegrift E，F(xiàn)uller VM，et al.Evaluation of degradation in DNA from males w ith a quantitative gender typing，endpoint PCR multiplex［J］.J Forensic Sci，2015，60（2）：399-408.

［5］Ruijter JM，Ramakers C，Hoogaars WM，et al.Amplification efficiency：linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（6）：e45.

［6］Mallona I，Weiss J，Egea-Cortines M.pcrEfficiency：a Web tool for PCR amplification efficiency prediction［J］.BMC Bioinformatics，2011，12：404.

［7］陳輝，劉永波，謝慶瑞，等.有機(jī)酚法和Chelex-100法提取不同組織微量DNA效果比較［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2004，39（6）：988-991.

［8］李紅霞，陳曉暉.精斑檢材的3種提取方法比較［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（5）：323-324.

（本文編輯：李成濤）

Application of the Peak Area Ratio of STR Loci to Amelogenin Locus in the Estimation of DNA Degradation

XIE Ya－ling1，LI Lu2，SHAO Cheng－chen1，WU Yi－h(huán)ui1，DU Tie－shuai1，ZHOU Huai－gu3，LI Hui3，XIE Jian－h(huán)ui1，SHEN Yi－wen1
（1.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China；2.Jing'an Branch of Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200040，China；3.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China）

Abstract：Objective To explore the change rules of peak area ratio of STR loci to Amelogenin（AMEL）locus（STR/AMEL），a sex－determ ining gene in DNA degradation，and to evaluate the application of STR/AMEL value in the estimation of DNA degradation degree.M ethods DNA was extracted from iliopsoas，and the variations of STR/AMEL value（Penta E/AMEL，Penta D/AMEL，F(xiàn)GA/AMEL）were analyzed after the artificial degradation was made by DNaseⅠ，and the changes of these three ratios of the iliopsoas naturally degraded in an outdoor environmentwere also analyzed.The regression curves were analyzed using the periods of DNA degradation and outside the body as the independent variable（x）and the STR/AMEL value as the dependent variable（y）and three curve equations under two conditions were established.Results Both under the conditions of artificial and natural degradation，STR/AMEL value had a negative relationship w ith the degradation time.The relationship between STR/AMEL and degradation time can be well simulated by the cubic function.R2was over 0.99 under controlled degradation condition and over 0.86 under natural degradation condition.Conclusion The STR/AMEL value（Penta E/AMEL，Penta D/AMEL，F(xiàn)GA/AMEL）is negatively related w ith the DNA degradation degree，which follows mathematical regression models strictly，and itm ight be applied to evaluate the DNA degradation degree.

Key words：forensic genetics；DNA degradation，necrotic；short tandem repeat；peak area

收稿日期：（2015-07-20）

通信作者：沈憶文，女，博士，副教授，主要從事法醫(yī)學(xué)教學(xué)、科研及鑒定；E－mail：shenyiwen＠fudan.edu.cn

作者簡介：解雅玲（1990—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)及法醫(yī)臨床學(xué)研究；E－mail：13211010068＠fudan.edu.cn

基金項目：上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實驗室基金資助項目（XCWZ20）

文章編號：1004－5619（2016）02－0105－04

中圖分類號：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.007