鹽酸小檗堿在黃連水煎液中的生物藥劑學分類系統(tǒng)屬性研究

隗麗　朱美玲　董月柳　董玲　劉洋　陳江鵬　尹秀文

[摘要]中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)的基礎研究之一是在多成分環(huán)境下對單一成分進行研究，即除成分自身溶解性和滲透性外，需結合多成分環(huán)境下造成的溶解性和滲透性各自提升度進行分類研究。該研究以小檗堿為主要研究對象，探究其在黃連水煎液中的水溶解性及腸滲透性變化規(guī)律。其中采用經典搖瓶法和高效液相色譜法測定小檗堿在不同pH緩沖液及不同濃度的黃連水煎液中的溶解度，并分別采用在體單向灌流模型及腸道灌流并行采血模型進行小檗堿的腸吸收和入血吸收的研究。

[關鍵詞]黃連；小檗堿；溶解性；腸滲透性；中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)

[Abstract]The study of single component in the multicomponent environment is one of the basic researches for biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） That is to say， the classification research shall be based on the respective lift of solubility and permeability in the multicomponent environment， besides solubility and intestinal permeability of the single component We chose berberine as the main research object to investigate the changes of its solubility and intestinal permeability in Huanglian decoction Shakeflask and HPLC were used to detect the solubility of berberine in different pH buffer solutions and different concentrations of Huanglian decoction In situ singlepass intestinal perfusion （SPIP） and intestinal perfusion with venous sampling （IPVS） were carried out to study berberine′s intestinal absorption and absorption into blood， respectively

[Key words]Coptidis Rhizoma； berberine； solubility； intestinal permeability； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

doi：10.4268/cjcmm20160706

口服藥物的水溶解性及腸滲透性是影響其胃腸道吸收的2個重要參數。生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）據此對藥物進行科學分類，確定藥物吸收過程中的限速過程，針對此進行合理的設計以獲得安全、有效的藥品[12]。目前BCS仍然在不斷地完善和發(fā)展，也衍生出了其他以不同側重點進行研究的分類系統(tǒng)[46]。但BCS針對的是單一成分的化學藥品，對于中藥多成分復雜體系而言并不適用，結合中藥自身特點與生物藥劑學分類系統(tǒng)的優(yōu)勢，本課題組提出了中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）[7]。基于“多成分層次差異比較法”的理論指導，課題組前期研究了模擬多成分環(huán)境對葛根素（葛根芩連方中君藥主要成分）的溶解性及滲透性的影響[89]，本研究旨在探究單一成分在藥材水煎液這一真實的多成分環(huán)境中的BCS屬性變化規(guī)律。黃連為葛根芩連方中的臣藥，具有抗菌、抗病毒、降血脂、降血糖等藥理作用[1011]，小檗堿為其主要活性成分，與黃連堿、巴馬汀及藥根堿的含量約占黃連總生物堿的95%，其中小檗堿約占50% [12]。因此，本研究選擇小檗堿為主要研究對象，探究其在黃連水煎液中的水溶解性及腸滲透性變化規(guī)律，以豐富中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)的研究，并為其進一步發(fā)展提供數據支持及研究基礎。

1 材料

11儀器

LC20AT高效液相色譜儀（SPD20A型紫外檢測器，SIL20A自動進樣器，日本島津公司）；BT25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH7200DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER 2100實驗室pH計（奧豪斯儀器上海有限公司）；蠕動泵（BT1001F，保定蘭格恒流泵有限公司）；注射泵（LSP021B，保定蘭格恒流泵有限公司）；高速冷凍離心機（SIGMA，德國）。

12藥物與試劑

鹽酸小檗堿對照品（批號110713201212，中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸小檗堿原料（批號130808，陜西中鑫生物技術有限公司）；乙腈（色譜級，美國Fisher公司）；黃連飲片購于北京同仁堂藥店。水合氯醛、氯化鈉注射液、磷酸、氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、三乙胺、碳酸氫鈉、氯化鈣（AR，北京化工廠）；純凈水（娃哈哈集團公司）。

13動物

SD大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）20140004。

2方法

21供試液的配制

KrebsRinger′s營養(yǎng)液（KR液）：稱取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2002 g，葡萄糖140 g，加蒸餾水定容至1 L，調節(jié)pH到739～741，放置備用。

黃連水煎液的制備：取適量黃連藥材加10倍量水，常溫浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過；藥渣加8倍量的水煎煮保持微沸30 min，趁熱抽濾，合并2次濾液，濃縮，冷至常溫，加水定容得黃連水煎液，相當于生藥質量濃度60 g·L-1，備用。

灌流液制備：取黃連水煎液用KR液稀釋至生藥質量濃度為3，12，30 g·L-1灌流液。

22不同pH緩沖液的配制

pH 10鹽酸溶液：量取鹽酸溶液9 mL，加水稀釋至1 L，調節(jié)pH至10，即得。pH 25緩沖液：取磷酸二氫鉀100 g，加水800 mL，用鹽酸調節(jié)pH至25，用水稀釋至1 L，調節(jié)pH至25，即得。pH 40緩沖液：取一水枸櫞酸1290 g，磷酸氫二鈉2725 g，加水1 L溶解，調節(jié)pH至40，即得。pH 68緩沖液：取磷酸二氫鉀170 g和磷酸氫二鉀178 g，加水溶解稀釋至1 L，調節(jié)pH至68，即得。pH 70緩沖液：取02 mol ·L-1磷酸二氫鉀溶液250 mL和02 mol ·L-1氫氧化鈉溶液1455 mL混合，加水稀釋至1 L，調節(jié)pH至70，即得。pH 74緩沖液：取磷酸二氫鉀681 g，加01 mol ·L-1氫氧化鈉溶液395 mL稀釋至1 L，調節(jié)pH至74，即得。

23鹽酸小檗堿含量測定方法

231色譜條件采用Luna C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm，Phenomenex，USA），檢測波長270 nm，流速10 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流動相水（04%磷酸，08%三乙胺）乙腈，梯度洗脫（0～11 min，87∶13～87∶13；11～12 min，87∶13～83∶17；12～17 min，83∶17～83∶17；17～26 min，83∶17～76∶24；26～385 min，76∶24～71∶29；385～45 min，71∶29～68∶32；45～65 min，68∶32～32∶68；65～75 min，32∶68～87∶13）。

232標準曲線制備精密量取小檗堿對照品貯備液（10 g·L-1）配制質量濃度分別為0200 4，0400 8，2004，1002，2004，4008，8016，12024 mg·L-1的對照品溶液，精密取上述對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以藥物質量濃度C（mg·L-1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。

233精密度試驗取含藥灌流液于1 d內HPLC重復測定6次，測定峰面積。

234穩(wěn)定性試驗含藥灌流液于0，2，4，6，12，24 h取樣檢測，測定峰面積。

235回收率考察精密吸取高、中、低3個濃度含藥灌流液，每個濃度平行3份，各精密加入對照品灌流液，測定峰面積，以測得濃度與實際濃度做比較計算方法回收率。

24鹽酸小檗堿在不同環(huán)境中溶解度的測定

241鹽酸小檗堿在不同pH緩沖液中溶解度的測定稱取待測小檗堿原料藥適量，置25 mL具塞試管中，加入不同pH緩沖液10 mL，37 ℃水浴加熱，每隔5 min振搖30 s，觀察30 min，直至待測物不再溶解，得到飽和溶液。取出室溫靜置10 min后，過045 μm微孔濾膜過濾，得續(xù)濾液。加入相應的緩沖液稀釋至一定濃度，搖勻過濾，高效液相色譜法測定其平衡溶解度。

242黃連水煎液中鹽酸小檗堿在pH 74緩沖液中溶解度的測定分別取不同生藥質量濃度（3，12，30 g·L-1，調pH至74）的黃連水煎液各10 mL，置25 mL具塞試管中，加入小檗堿原料藥200 mg，（37±1） ℃水浴加熱，每隔5 min振搖30 s，觀察30 min，直至待測物不再溶解，得到飽和溶液。室溫條件下靜置10 min，過045 μm微孔濾膜過濾，得續(xù)濾液，分別加入pH 74緩沖液稀釋至一定濃度，高效液相色譜法測定其平衡溶解度。

25大鼠在體腸吸收實驗方法

251大鼠在體單向腸灌流實驗大鼠禁食不禁水18 h，稱重，10%水合氯醛麻醉，沿腹中線剪開腹部3～4 cm，分離實驗用腸段，各腸段取約10 cm，腸段進口端與注射泵相連，用預熱至37 ℃的生理鹽水以5 mL·min-1的速度對所取腸道進行沖洗。流速調為02 mL·min-1灌流藥液，約30 min后吸收達到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計時，用已知質量的小瓶在出口處每隔15 min收集一次，計算收集前后小瓶質量稱量差，同時測定收集液的密度，以此方法對灌流液的體積校正。實驗結束后處死大鼠并剪下被灌流的腸段，測量其長度和內徑。按231項下色譜條件測定不同時間段流出藥液中鹽酸小檗堿含量。

252大鼠腸道灌流并行采血實驗大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，右側頸靜脈插管連接到蠕動泵進行供血。打開腹部，選取腸段，用37 ℃的生理鹽水沖洗干凈，結扎實驗用腸段以外的血管。對所取灌流腸段對應的腸系膜靜脈插管，并連接到蠕動泵，收集腸系膜靜脈流出血液。腸段進口端與注射泵相連，將注射泵流速調為02 mL·min-1，灌流藥液，約30 min后吸收達到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計時收集流出的藥液和血液。每隔15 min更換腸液和血液的收集管。采用質量法進行水分校正。試驗結束后，用生理鹽水沖洗腸段，將所用腸段剪下，測量其長度和內徑，并處死大鼠。所取血液樣品3 500 r·min-1離心15 min，取上層血漿，加入3倍量的甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，1萬 r·min-1離心15 min，取上清液定容至5 mL，經045 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液注入高效液相色譜儀進行檢測；灌流液樣品經045 μm的微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀進行檢測。

253數據分析[13]在體大鼠單向灌流中采用重量法校正水分吸收，計算有效滲透系數Peff、腸吸收速率常數Ka和腸吸收分數Fa。

Peff=-Qin·ln[Cout（cor）/Cin]2πrL

Ka=（1-Cout（cor）Cin）QinV

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qout=Mout/Doutt

式中Qin是灌流液流速（mL·min-1），L是灌流腸段長度（cm）；r是灌流腸段半徑（cm）；Cin是灌流液中鹽酸小檗堿初始質量濃度（mg·L-1）；Cout（cor）是經重量法校正后的灌流收集液中鹽酸小檗堿質量濃度（mg·L-1）；V=πr2L是灌流腸道體積（mL）；Qout是通過灌流液流出的速度（mL·min-1）；Cout是灌流收集液中鹽酸小檗堿質量濃度（mg·L-1）；Mout是灌流收集液質量（g），Dout是灌流收集液密度（g·mL-1），t是取樣周期（min）。

腸道灌流并行采血實驗采用重量法校正水分吸收，計算有效滲透系數Pblood。

Pblood=ΔMB/Δt2πrL·

=Cout（cor）-C0ln[Cout（cor）/C0]

式中ΔMB/Δt是血液樣品中鹽酸小檗堿物質的量（μg·sec-1）；是灌流腸段內鹽酸小檗堿對數平均質量濃度（mg·L-1）；L是灌流腸段長度（cm）；r是灌流腸段半徑（cm）；Cout（cor）是鹽酸小檗堿校正后灌流收集液質量濃度（mg·L-1），C0是鹽酸小檗堿初始灌流液質量濃度（mg·L-1）。

3結果

31藥物濃度的測定

分別取空白灌流液、對照品溶液、含藥灌流液、空白血漿及含藥血漿進行液相檢測，考察該色譜條件下空白灌流液及空白血漿對樣品含量測定的干擾。結果見圖1，空白灌流液及空白血漿在231項下色譜條件對藥物測定無干擾，說明該方法專屬性良好。鹽酸小檗堿的線性回歸方程為Y=95 717X-8 5529，R2=0999 1，結果表明，小檗堿在0200 4～12024 mg·L-1線性關系良好。本方法測定的精密度及穩(wěn)定性實驗RSD均小于10%。加樣回收率9987%～1029%，RSD均小于50%。

322黃連水煎液中小檗堿的溶解度小檗堿在不同質量濃度黃連水煎液（生藥質量濃度為3，12，30 g·L-1）中的溶解度測定結果見表1。小檗堿溶解度隨著黃連生藥濃度的增大而增大，在中、高濃度時比單一小檗堿溶解度要高。在低濃度時溶解度較單一成分比減小，推測黃連水煎液中可能存在某些成分在低濃度時對小檗堿的溶解度為抑制作用，高濃度時為促進作用。

33鹽酸小檗堿在不同環(huán)境中的滲透性測定

331小檗堿單體在不同的濃度和腸段中吸收參數不同質量濃度小檗堿灌流液（40，80，120 mg·L-1）在各個腸段間的吸收參數見表2。小檗堿在不同腸段單灌流的滲透系數Peff均<5×10-5 cm·s-1，為低滲透性的藥物。小檗堿的腸吸收速率常數的數量級在1×10-4級別，回腸、結腸吸收速率常數較低?？漳c吸收分數最高，結腸吸收分數最低。由此可見，小檗堿在小腸上端吸收較好，中、高濃度比低濃度吸收好，大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸在高中低濃度下吸收速率參數（Ka）無顯著性差異，提示藥物的吸收機制可能為被動擴散。小檗堿在不同腸段吸收分數都較低，約在4%左右。

332黃連水煎液中小檗堿在不同的濃度和腸段中吸收參數根據小檗堿在體單向灌流實驗結果，選擇大鼠空腸段進行不同濃度的黃連水煎液的在體單向灌流實驗及腸道血管并行采血實驗，結果見表3。黃連水煎液（3 g·L-1）中小檗堿質量濃度與小檗堿單一成分（80 mg·L-1）質量濃度相當時，黃連水煎液中小檗堿的腸吸收參數Peff和Ka均顯著增加（P<005），且水煎液中小檗堿的吸收速率隨著生藥濃度的增加而增大。同時，黃連水煎液（3 g·L-1）的吸收入血滲透系數較單一成分而言有所增大，而高濃度黃連水煎液Pblood相比較于單一小檗堿的Pblood發(fā)生了數量級的變化。

4討論

鑒于生物藥劑學分類系統(tǒng)的科學性及實用性，F(xiàn)DA，EMA及WHO將其引入到指導原則中進行藥物生物等效性豁免的評價研究，但是其在中藥相關領域的研究甚少。中藥的多成分及多成分的體內相互作用等使得分類研究十分困難，有研究[15]對中藥中已明確的化學成分對照品進行臨時的生物藥劑學分類，為確保藥品的質量提供有力的保證，但該研究并未真正將中藥的多成分環(huán)境納入到分類研究的考慮之中。中藥的本質屬性為多成分之間共同作用發(fā)揮療效，中藥中的成分均處于受其他各種成分構成的多成分環(huán)境的影響中，成分之間的影響可能會使得中藥成分乃至中藥整體的水溶解性與腸滲透性發(fā)生變化，而這種變化是可測的。

本研究中由小檗堿單一成分的實驗結果可知，其溶解性和滲透性均較低，為BCS第Ⅳ類藥物，依據CMMBCS分類標準，初步定為CMMBCSⅣ類，即自身溶解性和滲透性均較差的藥物。而黃連水煎液中小檗堿的BCS屬性溶解性和滲透性相比較于單一小檗堿有所不同。小檗堿的溶解度隨著黃連水煎液生藥濃度的增加而增大，表明了藥材濃度的增大有利于小檗堿溶解度的增加。在體單向腸灌流實驗結果顯示黃連水煎液中小檗堿的吸收速率隨著生藥濃度的增加而增大，也表明小檗堿存在被動轉運機制。且黃連水煎液中小檗堿能通過腸壁吸收進入血液，從高濃度黃連水煎液的Pblood結果看出，吸收入血量明顯增大，且發(fā)生了數量級的變化。黃連水煎液（3 g·L-1）中小檗堿的滲透性大于小檗堿單一成分（80 mg·L-1），吸收入血的滲透性也大于小檗堿單一成分。說明小檗堿在單個藥材中比單一成分更有利于其吸收。雖然黃連水煎液中小檗堿溶解性和滲透性有所改變，但提升不高，初步定為自身于溶解性和滲透性差且在單個藥材環(huán)境下提升不高的CMMBCSⅣ類。

對于中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)研究而言，需要從單一成分研究上升到中藥多成分甚至中藥整體研究，本研究則以小檗堿單一成分的水溶解性及腸滲透性為研究基礎，進一步研究了其在中藥多成分環(huán)境中的變化規(guī)律。但對整體研究而言，不僅化學成分眾多，而且所含大部分成分的藥理作用也未能一一闡釋清楚，除此之外，大多數中藥在使用過程中用量并不十分明確，對中藥整體進行生物藥劑學分類需考慮其他成分對每一成分的影響。

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[責任編輯孔晶晶]