玄參化學(xué)成分的HPLC睧SI睮T睺OF睲S分析

王靜哲　徐風(fēng)　劉震　馬立滿　尚明英　劉廣學(xué)　蔡少青

[摘要]應(yīng)用HPLCESIITTOFMS技術(shù)對玄參中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。采用Kromasil 1005 C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），以乙腈01%甲酸溶液為流動相梯度洗脫；質(zhì)譜使用ESI離子源，正離子與負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過分析質(zhì)譜信息及元素組成，并參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，共指認(rèn)了64個化合物；其中新化合物2個，4hydroxy6Omethylcatalpol和acetylangoroside C；玄參中首次報道的化合物17個，其中環(huán)烯醚萜苷類12個，苯丙素苷類3個，其他類2個。HPLCESIITTOFMS技術(shù)能快速準(zhǔn)確地分析玄參中所含的主要成分，研究結(jié)果為闡明玄參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]玄參；HPLCESIITTOFMS；環(huán)烯醚萜苷；苯丙素苷

[Abstract]This experiment was performed to establish a qualitative analysis on chemical constituents of Scrophulariae Radix by HPLCESIITTOFMS.The analysis was conducted on a C18 column （Kromasil 1005， 46 mm×250 mm， 5 μm） with 01% formic acidacetonitrile as the mobile phase for gradient elution； ESI ion source was used for mass spectra， and data were collected innegative and positive modes The results showed that 64 compounds from Scrophulariae Radix had been identified by analyzing negative ion mass data including element composition and by comparing with data from literature Two new compounds （4hydroxy6Omethylcatalpol and acetylangoroside C） and seventeen known compounds were detected from Scrophulariae Radix for the first time Seventeen known compounds included twelve iridoid glycosides， three phenylpropanoid glycosides and two other kind compounds This study will provide chemical basis for elucidation of the effective substance in the Scrophulariae Radix.

[Key words]Scrophulariae Radix； HPLCESIITTOFMS； iridoid glycosides； phenylpropanoid glycosides

doi：10.4268/cjcmm20160717

玄參為玄參科植物浙玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根[1]。玄參藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性微寒，味甘、苦、咸，歸肺、胃、腎經(jīng)；其傳統(tǒng)功效為涼血滋陰、瀉火解毒[12]。玄參主要含有環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷、苯乙醇苷及多糖等化學(xué)成分[34]；具有抗炎[56]、抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[78]、降血壓[910]、抗動脈粥樣硬化[1112]和神經(jīng)保護(hù)[13]等藥理作用。

為了全面認(rèn)識玄參化學(xué)成分的組成，本研究采用LCMS聯(lián)用技術(shù)，對玄參50%甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析，為玄參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

11儀器

島津Shimadzu LCESIITTOFMS液質(zhì)聯(lián)用儀（日本，島津公司）；MilliQ純水機(jī)（美國，密理博MilliQ，Integral 3）；1/10 萬電子天平（德國，Sartorius， BP211D）；小型粉碎機(jī)（北京弘荃翔和機(jī)械技術(shù)有限公司，RT02A）；數(shù)碼超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司，KQ500DE型）。

12 試劑

色譜純甲醇（Fisher， Scientific， A4524）；色譜純乙腈（Fisher，lot 106246）；色譜純甲酸（ROE， zk3004）；MilliQ超純水。

13藥材

玄參于2013年購于浙江省磐安縣，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院尚明英副教授鑒定為玄參科植物浙玄參S ningpoensis的根，憑證標(biāo)本（No7706）保存于北京大學(xué)藥學(xué)院生藥標(biāo)本室。

2 方法

21 液相條件

Kromasil 1005 C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；Agilent Zorbax SBC18保護(hù)柱（46 mm×125 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃。以01%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序為0～10 min，0% B；10～20 min，0%～3%B；20～23 min，3% B；23～38 min，3%～8% B；38～45 min，8%～19% B；45～50 min，19% B；50～63 min，19%～27% B；63～73 min，27% B；73～83 min，27% ～55% B；83～93 min，55%～100% B。流速為10 mL·min-1，柱后分流02 mL·min-1進(jìn)入質(zhì)譜儀。進(jìn)樣量為10 μL。

22 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜檢測條件為ESI離子源；MS1～MS3檢測范圍m/z 50～1 000；離子累積時間20～30 ms；霧化氣（氮氣）流速15 L·min-1；曲型脫溶劑管和加熱塊溫度200 ℃；CID能量50%；檢測器電壓，170 kV；干燥氣（氮氣）壓力980 kPa；檢測模式正、負(fù)離子切換檢測。

23 供試品制備

玄參粉末（過40目篩）約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇20 mL，密塞，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，過022 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

24 HPLCESIITTOFMS分析

應(yīng)用HPLCESIITTOFMS技術(shù)對玄參化學(xué)成分進(jìn)行分析，根據(jù)飛行時間質(zhì)譜正、負(fù)離子模式下測得的準(zhǔn)分子離子峰，確定精確的相對分子質(zhì)量，應(yīng)用質(zhì)譜分析軟件計算分子組成，將理論值與實測值進(jìn)行比較，結(jié)合多級碎片離子及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測玄參中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。在玄參提取物中共指認(rèn)了64個化學(xué)成分，其中苯丙素類19個，環(huán)烯醚萜苷類41個，其他類4個。玄參提取液負(fù)離子模式下基峰色譜圖，見圖1，具體信息見表1。

25玄參中主要成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律及結(jié)構(gòu)解析

251環(huán)烯醚萜苷類玄參中環(huán)烯醚萜苷類成分[15，42]，在碰撞能的作用下，如果分子中含有苯丙素的結(jié)構(gòu)時，首先會丟失苯丙素結(jié)構(gòu)單元（酯鍵斷裂），繼而丟失葡萄糖基（糖苷鍵斷裂），由于環(huán)烯醚萜苷元上有羥基的存在，會出現(xiàn)丟失水分子現(xiàn)象；除此之外環(huán)烯醚萜可能會發(fā)生開環(huán)和進(jìn)一步裂解。

玄參中環(huán)烯醚萜苷類成分含有4種亞型，其中環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷類成分在碰撞能量作用下，發(fā)生酯鍵和糖苷鍵斷裂后的母核離子為m/z 20108[M-H]-，其特征碎片離子為m/z 18307[M-H2O-H]-和m/z 16506[M-2H2O-H]-。

按照此規(guī)律，對20個環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷類成分P6，P12，P1417，P29，P32，P39，P40，P44，P47，P49，P50，P5355，P5758，P59進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析；其中P6（dihydroharpagide），P15（6Oβglucosylharpagide）和P12（6′Oβglucosylharpagide）及其同分異構(gòu)體（P16和P17）為玄參中首次報道。

P6的結(jié)構(gòu)確定：在負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 411149 0[M+HCOO]-和m/z 365144 0[M-H]-，預(yù)測其分子式為C15H26O10，預(yù)測誤差為-438。二級質(zhì)譜中可見m/z 347128 8[M-H2O-H]-，203093 5[M-glucosyl-H]-，179056 7，161048 1等碎片離子。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測該化合物為哈巴苷的還原產(chǎn)物dihydroharpagide [18]。

P12[20]，P15[21]，P16，P17的結(jié)構(gòu)確定：在負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜中可見P12和P15的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 571188 1[M+HCOO]-和m/z 571188 5[M+HCOO]-，預(yù)測其分子式為C21H34O15，預(yù)測誤差分別為018，088，因此二者為同分異構(gòu)體。其中P15負(fù)離子模式下二級質(zhì)譜主要碎片為m/z 525182 5，323093 8，201074 0，183071 4，179059 3。其中m/z 201078 1為[M-2glucosyl-H]-，m/z 183071 4為[M-H-2glucosyl-H2O]-，以上2個碎片離子均為哈巴苷苷元的特征碎片離子，m/z 323093 0為[2glucosyl-H]-，m/z 179059 3[glucose-H]-，因此推測P15結(jié)構(gòu)為harpagide苷元上連接2個相連的葡萄糖，經(jīng)查閱文獻(xiàn)推測該化合物為6′Oβglucosylharpagide[21]。而P12的二級質(zhì)譜主要碎片與P15相似，但是沒有m/z 3230930碎片離子，因此推測該化合物結(jié)構(gòu)中的2分子葡萄糖不直接相連，經(jīng)查閱文獻(xiàn)推測該化合物為6Oβglucosylharpagide[20]。P16和P17在負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜中可以觀測到其準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 571186 9[M+HCOO]-和m/z 571186 2[M+HCOO]-，經(jīng)高分辨數(shù)據(jù)預(yù)測其分子式均為C21H34O15，二級碎片離子可見m/z 32309，因此最終推測其均為6′Oβglucosylharpagide（P12）的同分異構(gòu)體，見圖2。

環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類成分，發(fā)生酯鍵和糖苷鍵斷裂后的母核離子為m/z 18307[M-H]-，其特征碎片離子為：m/z 16506[M-H2O-H]-和m/z 13506[M-H2O-CH2O-H]-，見圖3。按照此規(guī)律，對10個環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類成分P3P5，P7，P8，P10，P11，P13，P21，P56進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析。其中P4（6Oβglucosylaucubin）及其同分異構(gòu)體（P7和P10），P5（6′Oβglucosylaucubin）及其同分異構(gòu)體（P8，P11，P13）、P21（6Omethylaucubin）和P56（unduloside Ⅲ）為玄參中首次報道。

P5，P8，P11，P13結(jié)構(gòu)的確定：在負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜中可見P5的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 553176 1[M+HCOO]-，預(yù)測其分子式為C21H32O14，預(yù)測誤差為-235。負(fù)離子模式下二級質(zhì)譜主要碎片為m/z 323098 1，183033 0，179056 3，161046 3。其中m/z 323098 1為[2glucosyl-H]-，m/z 183033 0為[M-H-2glucosyl]-，與[aucubin-H-glucosyl]-碎片一致，m/z 179056 3為[glucose-H]-，m/z 161046 3為[glucosyl-H]-。根據(jù)以上碎片離子信息推測該化合物中存在aucubin苷元及2個相連葡萄糖結(jié)構(gòu)片段，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測該化合物為6′Oβglucosylaucubin[17]。P8，P11，P13在負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜中可見其準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 553175 0[M+HCOO]-，553176 0[M+HCOO]-， 553174 9[M+HCOO]-，經(jīng)高分辨數(shù)據(jù)預(yù)測其分子式均為C21H32O14，且二級碎片離子與P5碎片離子一致，因此推測其均為6′Oβglucosylaucubin（P5）的同分異構(gòu)體，見圖3。

P21結(jié)構(gòu)的確定：在負(fù)離子一級質(zhì)譜中可見準(zhǔn)分子離子峰m/z 405138 1[M+HCOO]-，經(jīng)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)測其分子式為C16H24O9，預(yù)測誤差為-518。二級質(zhì)譜主要碎片為m/z 197083 7，165048 8，135048 9。其中m/z 197083 7[aucubinglucosyl+CH2]-為[M-H-glucosyl]-，m/z 165048 8為[M-H-glucosyl-CH3OH]-， m/z 135048 9為[M-H-glucosyl-CH3OH-HCHO]-。根據(jù)上述質(zhì)譜碎片信息推測該化合物中存在葡萄糖、甲氧基和醛基結(jié)構(gòu)片段，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道，推測該化合物為6Omethylaucubin[2324]。

環(huán)氧環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷類，發(fā)生酯鍵和糖苷鍵斷裂后的母核離子為m/z 21307[M-H]-，其特征碎片離子為m/z 195067 3[M-H2O-H]-和m/z 183067 7[M-CH2O-H]-，見圖4。按照此規(guī)律，對10個環(huán)氧環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷類成分P1，P2，P1819，P27，P4546，P60，P62，P63進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析。其中P19 （ 3，4dihydromethylcatalpol ）（玄參屬），P27（ premnacorymboside B ），P60 （ scrophuloside A5 ），P45（ scrophuloside A2 ）及其同分異構(gòu)體（P46）均為玄參中首次報道，P2（4hydroxy6Omethylcatalpol）為新化合物。

P2結(jié)構(gòu)解析：在負(fù)離子模式一級質(zhì)譜中可見其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 439143 8[M+HCOO]-，經(jīng)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)測其分子式為C16H26O11，預(yù)測誤差為-433。負(fù)離子模式下二級質(zhì)譜主要碎片為m/z 231088 8， 213078 2， 195026 0， 183061 6，163045 2。其中m/z 213078 2， 195026 0， 183061 6， 163045 2均為6Omethylcatalpol的特征碎片離子。該化合物與6Omethylcatalpol （P18）分子式（ C16H24O10）相比多H2O，因此推測該化合物由6Omethylcatalpol中雙鍵發(fā)生水合反應(yīng)而來，即4hydroxy6Omethylcatalpol，見圖4，5。

除此之外在玄參中發(fā)現(xiàn)一種變異環(huán)烯醚萜苷類，P9（ningpogoside A）。

252苯丙素苷類玄參中苯丙素苷類成分主要特點是由α，β不飽和苯丙酸如肉桂酸（M=148）、阿魏酸（M=194）、咖啡酸（M=180）和香豆酸（M=164）等，與葡萄糖（M=180）、鼠李糖（M=164）及阿拉伯糖（M=150）等構(gòu)成苯丙素苷，同時糖結(jié)構(gòu)上時有苯乙醇結(jié)構(gòu)相連。苯丙素苷類在碰撞能的作用下，常發(fā)生苯丙素類結(jié)構(gòu)單元中性丟失，繼而丟失鼠李糖基（146），最后丟失阿拉伯糖基（132），見圖6。根據(jù)以上苯丙素苷類多級質(zhì)譜裂解規(guī)律，在玄參中共指認(rèn)19個苯丙素苷類成分，分別為P20， P22， P24， P26， P30， P31， P3338， P4143， P48， P51， P52， P61。其中P26（6′Oferuloylsucrose）， P37（sibirioside B）， P61（diacetylmartynoside），P35（scrophuloside B2）及其同分異構(gòu)體（P38）為玄參中首次報道，P51（acetylangoroside C）為新化合物。

P51結(jié)構(gòu)解析：在負(fù)離子模式一級質(zhì)譜中可見其準(zhǔn)分子離子峰m/z 871284 8[M+HCOO]-，預(yù)測其分子式為C38H50O20，預(yù)測誤差為-333。二級質(zhì)譜主要碎片為m/z 783265 1， 765252 8， 649212 8， 589203 5， 607231 9， 461155 3， 329124 7。其中m/z 783265 1， 649212 8， 589203 5， 607231 9， 461155 3， 329124 7均為angoroside C（P41）的特征碎片離子；m/z 783265 1為[M-H-acetyl]-和m/z 765252 8為[M-H-acetyl-H2O]-，因此推測該化合物具有與angoroside C相似的結(jié)構(gòu)并且有乙酰基，推測該化合物為angoroside C的乙?；a(chǎn)物acetylangoroside C。同時可見碎片離子m/z 649212 8[M-H-feruloyl]-，m/z 461155 3[M-H-feruloyl-acetylrhamnosyl]-為m/z 649212 8中性丟失188（乙酰鼠李糖基）得到的碎片離子，因此推測乙?；l(fā)生在鼠李糖基上，考慮到空間位阻，推測乙?；B接位置為鼠李糖結(jié)構(gòu)中2或3位的羥基，推測結(jié)構(gòu)見圖7。

253其他類成分鑒別除環(huán)烯醚萜苷和苯丙素苷類外，還指認(rèn)了2個苯乙醇苷類P23（deferuloylangoroside C）和P28（phenethyl βprimeveroside）、1個苯甲醇苷類P25（phenylmethyl 6OαLarabinopyranosylβDglucopyranoside）和1個二萜類化合物P64（sugiol）。其中P25和P28為玄參中首次報道。

P25和P28的結(jié)構(gòu)解析：在負(fù)離子模式一級質(zhì)譜中可見P28準(zhǔn)分子離子峰m/z 461166 0[M+HCOO]-，經(jīng)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)測其分子式為C19H28O10，預(yù)測誤差為-108。負(fù)離子模式二級質(zhì)譜中主要碎片為m/z 149039 7[arabinose-H]-，為m/z 415155 7[M-H]-中性丟失266（苯乙醇和葡萄糖基相連的碎片離子），經(jīng)查閱Scifinder數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)報道推測P28為phenethyl βprimeveroside[30]。在負(fù)離子模式一級質(zhì)譜中可見P25準(zhǔn)分子離子峰m/z 401144 7[M-H]-，經(jīng)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)測其分子式為C18H26O10，預(yù)測誤差為-150 ppm。負(fù)離子模式二級質(zhì)譜主要碎片為m/z 269101 4，161052 3，145105 4；其中m/z 269101 4為[M-H-arabinosyl]-，m/z 161052 3為[glucosyl-H]-，推測P25中也含有阿拉伯糖和葡萄糖結(jié)構(gòu)片段；并且P25與P28分子式（C19H28O10）相差CH2；因此推測P25與P28為同系物，經(jīng)查閱Scifinder數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)報道推測該化合物為phenylmethyl 6OαLarabinopyranosylβDglucopyranoside[27]。

26玄參中首次報道的化合物在植物中的分布

在玄參中指認(rèn)的64個化合物，除2個新化合物外，17個為玄參中首次報道。通過查閱文獻(xiàn)，對17個化合物在植物中的分布進(jìn)行了總結(jié)，見表2，其中13個化合物在玄參科其他植物中曾經(jīng)報道過，其余4個化合物中P12（6Oβglucosylharpagide）和P15（6′Oβglucosylharpagide）存在于唇形科，P25（phenylmethyl 6OαLarabinopyranosylβDglucopyranoside）存在于忍冬科，P26（6′Oferuloylsucrose）存在于車前科植物中，該三科均為玄參科的近緣植物[43]，見表2。

3結(jié)論與討論

本研究采用HPLCESIITTOFMS技術(shù)對玄參化學(xué)成分進(jìn)行分析，通過一級質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰和多級質(zhì)譜中的碎片離子信息，并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)共指認(rèn)玄參化學(xué)成分64個，包括苯丙素苷類19個、環(huán)烯醚萜苷類41個、其他類4個。玄參中首次報道的化合物19個；玄參科植物中首次報道化合物6個，分別為P2（4hydroxy6Omethylcatalpol）， P12（6Oβglucosylharpagide）， P15（6′Oβglucosylharpagide），P25（phenylmethyl 6OαLarabinopyranosylβDglucopyranoside）， P26（6′Oferuloylsucrose），P51（acetylangoroside C）， 其中P2和P51為新化合物。

玄參主要成分為苯丙素苷類和環(huán)烯醚萜苷類，本文鑒定的19個苯丙素苷類化合物結(jié)構(gòu)相似，多為同系物，該類成分的結(jié)構(gòu)特點為苯丙酸（如肉桂酸、阿魏酸和咖啡酸等）與葡萄糖、鼠李糖或蔗糖等縮合成苷（糖酯），其中8個化合物涉及同分異構(gòu)體。在鑒定的41個環(huán)烯醚萜苷類化合物中，環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷類20個，均為harpagide與苯丙酸或葡萄糖縮合而成，其中15個化合物涉及同分異構(gòu)體；環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類10個，均為aucubin與苯丙酸和葡萄糖縮合而成，其中7個化合物涉及同分異構(gòu)體；環(huán)氧環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷類10個，均為6Omethylcatalpol與苯丙酸、葡萄糖或苯乙醇等縮合而成，其中2個化合物互為同分異構(gòu)體。研究結(jié)果表明玄參中含有眾多的結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)成分，或為同分異構(gòu)體，或為同系物，或為母核上連接葡萄糖數(shù)目和位置不同；因此玄參在發(fā)揮藥效時，這些結(jié)構(gòu)相似的化合物很有可能會產(chǎn)生疊加作用[44]。

通過HPLCESIITTOFMS技術(shù)快速準(zhǔn)確地對玄參中復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，豐富了玄參的化學(xué)成分信息，為玄參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

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[責(zé)任編輯丁廣治]