杜仲Ref基因密碼子偏好性分析

劉慧敏 ，烏云塔娜 ，杜紅巖

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003）

杜仲是我國名貴的經(jīng)濟(jì)樹種，千百年來以作為中國傳統(tǒng)的中藥材而廣為人知[1]。近二十年來，隨著對杜仲研究的逐漸深入，科研工作者發(fā)現(xiàn)杜仲除了作為藥用植物外，還有其他重要的用途，其果皮、葉片和樹皮中都含有豐富的白色膠絲——杜仲膠[2]。杜仲膠(反式聚異戊二烯)是三葉橡膠（順勢聚異戊二烯）的同分異構(gòu)體，杜仲膠具有“橡塑”二重性[3]，使其在海底電纜、高爾夫球、輪胎、醫(yī)療器械等多領(lǐng)域發(fā)揮獨(dú)特作用[4]。與三葉橡膠相比，杜仲有病蟲害少、適應(yīng)性廣等多種優(yōu)點，又是我國特有的樹種，已被提到國家戰(zhàn)略資源的高度[5]，因此具有巨大的開發(fā)價值，是能夠替代三葉橡膠的最佳膠源樹種。

盡管杜仲具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，其杜仲膠合成途徑尚不完全清楚，杜仲膠合成上游有兩條途徑MEP和MVA途徑，MEP和MVA途徑在植物中廣泛存在，它們的終產(chǎn)物IPP是所有萜類物質(zhì)合成的前體物質(zhì)。杜仲膠合成下游涉及的基因主要有橡膠延長因子（Rubber elongation factor）、小顆粒橡膠蛋白（Small rubber particle protein）等。橡膠延伸因子（Ref）基因是巴西橡膠樹產(chǎn)膠相關(guān)的重要功能基因，是一種與橡膠粒子緊密結(jié)合的蛋白，約為14 kDa，占膠乳總蛋白的10%～60%，是異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶催化多聚異戊二烯單元添加到橡膠分子中不可缺少的成分。已有研究者克隆了三葉橡膠Ref基因的全長或cDNA片段[6-8]，并對其在橡膠樹基因組中進(jìn)行了物理定位[9]，然而該基因在杜仲研究較少，2012年Suzuki等人在構(gòu)建杜仲EST文庫時發(fā)現(xiàn)在杜仲中存在該基因[10]。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究用到的杜仲Ref基因序列來源于GenBank（accession number: KJ413007）,經(jīng)過人工檢驗，該基因序列以ATG開頭，以TAA結(jié)尾，序列長度為678 bp，且序列中間無N或終止密碼子，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

數(shù)據(jù)分析用到的四種模式生物大腸桿菌（Escherichia coli）、 酵 母（Saccharonmyces cerevisine）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草（Nicotiana tabacum）的密碼子偏性數(shù)據(jù)下載于 Codon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon/）數(shù)據(jù)庫。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

首先運(yùn)用CUSP和CodonW軟件對杜仲Ref基因進(jìn)行密碼子組成和使用偏好性分析，密碼子組成分析主要包括GC含量（鳥嘌呤和胞嘧啶含量）；A3s、T3s、G3s、C3s（同義密碼子在第3位上腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶的出現(xiàn)頻率）；GC3s（同義密碼子第3位的G+C含量）。密碼子使用偏好性分析主要包括ENC（有效密碼子數(shù)）；RSCU（同義相對密碼子使用度）；Frequency（密碼子使用頻率）；Fraction（單個密碼子在其同義密碼子中出現(xiàn)的比例）。

有效密碼子數(shù)（effective number of codons,ENC or Nc）是檢測單個基因的密碼子偏好程度，取值范圍為20（每個氨基酸只使用一個密碼子）到61（各個密碼子被均衡使用）。其值越低，表明該基因的密碼子使用偏好性越強(qiáng)[11-12]。

同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage, RSCU）是指對于某一特定的密碼子，在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對概率，去除了氨基酸組成對密碼子使用的影響。該值的計算方法為某一密碼子所使用的頻率與其在無偏使用時預(yù)期頻率之間的比值[13-14]，如果密碼子使用無偏好性，則RSCU值為1；如果該密碼子比其他密碼子使用更頻繁，則其RSCU值大于1；反之亦然[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲Ref基因的密碼子組成及ENC值

運(yùn)用CodonW統(tǒng)計杜仲Ref基因的密碼子組成及有效密碼字?jǐn)?shù)（ENC），結(jié)果見表1。杜仲Ref基因的ENC值為56.18，表明杜仲Ref基因密碼子偏好性比較弱且基因表達(dá)水平偏低。Ref基因的GC含量為49%，密碼子第三位堿基的GC含量GC3s為59%，表明杜仲Ref基因編碼區(qū)序列中G+C含量（49%）與A+T（51%）含量相當(dāng)，略微偏好于使用以G/C結(jié)尾的密碼子。Ref第三位上各個堿基（A、T、G、C）的含量分別為：23%、28%、31%和43%。

表1 杜仲Ref基因的密碼子組成及使用參數(shù)Table 1 Composition and parameters of EuRef gene

2.2 杜仲Ref基因的密碼子使用偏好性分析

運(yùn)用CodonW和CUSPS分析杜仲Ref基因的密碼子使用偏好性，包括RSCU（同義密碼子相對使用度）和Fraction（單個密碼子在其同義密碼子中出現(xiàn)的比例，每個氨基酸的同義密碼子fraction的和等于1），結(jié)果見表2。結(jié)果表明：在杜仲Ref基因的密碼子中共有28個密碼子的RSCU值大于1，為杜仲Ref基因的偏好密碼子，其中17個密碼子以G/C結(jié)尾，9個密碼子以A/T結(jié)尾，與其密碼子第三位堿基組成中GC含量（59%）的結(jié)果相吻合；同義密碼子相對使用度RSCU值較大的密碼子其相應(yīng)的Fraction值也比較大；其中4個密碼子（GTA、ACT、CGG、AGT）的相對使用度為0，在杜仲Ref基因中未被使用。

杜仲Ref基因的密碼子與大腸桿菌、酵母、擬南芥和煙草基因組的密碼子偏好性比較

表3列出了杜仲Ref基因、大腸桿菌、酵母、擬南芥和煙草基因組的密碼子使用頻率（單個密碼子在編碼基因總密碼子出現(xiàn)的頻率，1/1 000），并計算杜仲Ref基因密碼子使用頻率與其它4個模式物種密碼子使用頻率的比值，不同物種或基因的密碼子使用頻率比值在0.5～2.0之間的，表明對該密碼子的使用偏好性較為接近；反之，,若比值≤0.5或≥2.0，表明對該密碼子的使用偏好差異較大。

杜仲Ref基因與大腸桿菌相比有23個密碼子使用差異較大，與擬南芥相比有22個密碼子的使用差異較大，與煙草相比有25個密碼子的使用差異較大，與酵母相比有24個密碼子的使用差異較大。

表2 杜仲Ref基因的密碼子偏好性Table 2 Codon bias of EuRef gene

3 結(jié)論與討論

本研究以杜仲Ref基因為研究對象，運(yùn)用CodonW等軟件分析了杜仲Ref基因的密碼子組成及偏好性，基因的GC含量為49%，密碼子第三位堿基的GC含量GC3s為59%，有效密碼子數(shù)為56.18，表明杜仲Ref基因的密碼子偏好性較弱且基因的表達(dá)水平較低。

同義密碼子相對使用度和Fraction分析表明，杜仲Ref偏好使用28個密碼子且這些密碼子大部分（17）個以G/C結(jié)尾。

通過將杜仲Ref基因的密碼子使用頻率與大腸桿菌、酵母、擬南芥和煙草比較發(fā)現(xiàn)，杜仲Ref基因的密碼子使用偏好與四個物種的密碼子使用偏好差異均較大，與擬南芥密碼子的使用偏好相對較接近，考慮到擬南芥中有杜仲膠合成上游途徑MEP和MVA途徑，因此擬南芥更適宜作為Ref轉(zhuǎn)基因的受體，通過密碼子改造可以提高Ref基因在宿主中的表達(dá)。杜仲Ref基因與煙草密碼子的使用偏好差異最大，可能是因為Ref基因的長度較短，密碼子數(shù)量較少引起的。

表3 杜仲Ref基因的密碼子與大腸桿菌、酵母、擬南芥、煙草的密碼子偏好性比較Table 3 Comparison of codon bias among EuRef gene and E.coli, A.thaliana, N.tabacum and S.cerevisiae

此分析結(jié)果可應(yīng)用于杜仲Ref轉(zhuǎn)基因功能驗證中模式生物的選取，Ref基因密碼子的優(yōu)化改造，為該基因后續(xù)研究工作的開展提供理論基礎(chǔ)。

續(xù)表 3Continuation of table 3

參考文獻(xiàn)：

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