HPLC法同時(shí)測(cè)定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量

王志軒，劉喜綱，崔小麗，鄭曉英，劉翠哲*

(1．河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000； 2.承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 承德 067000)

HPLC法同時(shí)測(cè)定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量

王志軒1，2，劉喜綱1，崔小麗2，鄭曉英2，劉翠哲1*

(1．河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，承德 067000； 2.承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 承德 067000)

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素含量的方法。方法：采用Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；甲醇-乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)356 nm。 結(jié)果：金絲桃苷、槲皮素、山柰素分別在4.85～194.25、5.05～202.07和4.90～196.27 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為97.34%、96.79%和97.56%，RSD 分別為1.60%、1.01%和1.40%。結(jié)論：建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于照山白藥材的質(zhì)量控制。

照山白，金絲桃苷，槲皮素，山柰素，HPLC

照山白別名萬(wàn)斤、萬(wàn)經(jīng)棵，為雙子葉植物杜鵑花科植物小花杜鵑(RhododendronmicranthumTurcz)的枝葉或花，具有止咳化痰、祛風(fēng)通絡(luò)、調(diào)經(jīng)止痛等功效，可用于治療急慢性氣管炎、哮喘、痛經(jīng)、產(chǎn)后周身疼痛等病癥[1-3]。照山白的主要成分為酚酸類化合物[4]、三萜類化合物[5，6]以及黃酮類化合物[7-9]，其中金絲桃苷、槲皮素、山柰素等黃酮類化合物含量較高。近年研究表明，金絲桃苷、槲皮素和山柰素具有抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和抗癌等多種藥效[10-12]。

照山白中黃酮類成分的含量測(cè)定方法有分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等[13]。已有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC測(cè)定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的含量[14]，以及用 HPLC測(cè)定宣木瓜中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量[15]，但未有文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定照山白中金絲桃苷、槲皮素、山柰素的含量。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC法同時(shí)測(cè)定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素3種成分的含量，為照山白藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀；電子分析天平(METTLER TOLEDO XPE26DR)。

1.2 試藥 對(duì)照品：金絲桃苷(批號(hào)111521-201205，含量93.3%)、槲皮素(批號(hào)100081-200907，含量96.5%)、山柰素(批號(hào)110861-201310，含量93.2%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；照山白藥材分別采集于吉林省通化、河北省灤平、寬城，經(jīng)河北省食品藥品檢定研究院段吉平研究員鑒定為杜鵑花科植物小花杜鵑(照山白)；乙腈(Fisher Scientific，美國(guó))；甲醇(分析純，天津市康科德科技有限公司)；磷酸(分析純，天津佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱采用Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：[甲醇-乙腈(13∶11)]為A，0.1%磷酸為B，梯度洗脫(0～40 min, 25%A；40～60 min, 38%A；60～80 min, 43%A)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)356 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.50 mg、槲皮素對(duì)照品10.47 mg、山柰素對(duì)照品10.53 mg，置50 ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，定容，搖勻，配制成金絲桃苷濃度為195.93 μg/ml、槲皮素濃度為202.07 μg/ml和山柰素濃度為196.27 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取粉碎后的照山白粉末約1 g，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，用70%甲醇補(bǔ)足重量，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖1，表明在此色譜條件，金絲桃苷、槲皮素和山柰素3種成分分離良好。

2.4 線性關(guān)系考查 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、2.5、5.0、7.5和10.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到3種成分的系列濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，分別以3種對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，作圖，得到金絲桃苷、槲皮素和山柰素的回歸方程為：金絲桃苷Y=12 1110 715.40X-10 550 469.80(r=0.999 1，n=6);槲皮素Y=12 1110 715.40X-10 558 469.80(r=0.998 7，n=6);山柰素Y=238 205 793.70X-20 836 336.90(r=0.998 6，n=6)。結(jié)果表明，金絲桃苷、槲皮素和山柰素分別在4.85～194.25、5.05～202.07和4.90～196.27 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.金絲桃苷 2.槲皮素 3.山柰素

圖1 混合對(duì)照品(A)供試品(B)HPLC色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取3種成分的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算金絲桃苷、槲皮素和山柰素峰面積RSD分別為1.1%、0.14%和0.88%。表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取粉碎后的同一樣品6份，每份1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得樣品中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的平均含量分別為5.10、0.10和0.40 mg/g，RSD分別為0.71%、0.56%和1.5%，表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液10 μl，分別于0、2、6、12、24和48 h進(jìn)樣，結(jié)果樣品中3種成分金絲桃苷、槲皮素和山柰素峰面積的RSD分別為0.51%、1.5%和1.7%。表明金絲桃苷、槲皮素和山柰素在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取9份已知含量樣品,每份約0.5 g，分別加入一定量的金絲桃苷、槲皮素和山柰素對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，計(jì)算金絲桃苷、槲皮素和山柰素的回收率，結(jié)果金絲桃苷平均回收率為97.34%，RSD為1.60%；槲皮素平均回收率為96.79%，RSD為1.01%；山柰素平均回收率為97.56%，RSD為1.40%。見(jiàn)表1-3。

表1 金絲桃苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 槲皮素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 山柰素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定 分別取不同批號(hào)照山白藥材5份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 照山白中化學(xué)成分較復(fù)雜，檢測(cè)組分較多，實(shí)驗(yàn)中曾選擇過(guò)不同比例的甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、[甲醇-乙腈(1∶1)]-0.1%磷酸、[甲醇-乙腈(13∶11)]-0.1%磷酸等流動(dòng)相，其中以[甲醇-乙腈(13∶11)]-0.1%磷酸分離效果最為良好，故選擇該流動(dòng)相體系。

3.2 提取方法的選擇 在供試品制備時(shí)分別考查了甲醇回流提取、乙醇回流提取、索氏提取器提取、超聲提取等不同方法，發(fā)現(xiàn)超聲提取即可提取完全；又對(duì)不同濃度的甲醇進(jìn)行考查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取完全，同時(shí)對(duì)超聲處理的時(shí)間進(jìn)行了考查，發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min即可提取完全。

3.3 產(chǎn)地和采收季節(jié)的影響 從結(jié)果來(lái)看，不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)對(duì)金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量均有影響。從產(chǎn)地來(lái)看，吉林產(chǎn)照山白中槲皮素含量最高，采收自灤平的照山白中山柰素含量最高。從采收季節(jié)來(lái)看，承德地區(qū)5月份采收的照山白中金絲桃苷、山柰素均高于7月、10月采收，槲皮素含量也較高，為照山白比較適合的采收季節(jié)。

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2015-10-29

河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No.冀教高[2003]4號(hào))

R917

A

1006-5687(2016)01-0015-03

*通訊作者: 劉翠哲，E-mail: liucuizhexy@163.com。